Abstracto
Antecedentes Los enlaces cruzados de disulfuro de mucina median la formación de moco patológico en enfermedades pulmonares mucoobstructivas. MUC-031, un nuevo compuesto carbohidrato modificado con tiol, escinde disulfuros para causar mucólisis. El objetivo de este estudio fue determinar los efectos mucolíticos y terapéuticos de MUC-031 en esputo de pacientes con fibrosis quística (FQ) y ratones con enfermedad pulmonar mucoobstructiva (ratones βENaC-Tg).
Métodos Comparamos la eficacia mucolítica de MUC-031 y los mucolíticos existentes (N-acetilcisteína (NAC) y desoxirribonucleasa I humana recombinante (rhDNase)) usando reología para medir el módulo elástico (G ‘) del esputo CF, y probamos los efectos de MUC- 031 sobre taponamiento de moco en las vías respiratorias, inflamación y supervivencia en ratones βENaC-Tg para determinar su eficacia mucolítica en vivo.
Resultados En el esputo de FQ, en comparación con los efectos de la rhDNasa y la NAC, MUC-031 causó una mayor disminución en el G’ del esputo, fue más rápido en la disminución del G’ del esputo en un 50 % y provocó la mucólisis de una mayor proporción de muestras de esputo dentro de los 15 minutos posteriores al fármaco. suma. En comparación con el control del vehículo, tres tratamientos con MUC-031 en 1 día en ratones adultos βENaC-Tg redujeron el contenido de moco en las vías respiratorias (16,8 ± 3,2 versus 7,5±1,2 nL·mm−2p<0,01) y células de lavado broncoalveolar (73 833±6930 versus 47 679±7736 células·mL−1, p<0,05). El tratamiento dos veces al día con MUC-031 durante 2 semanas también provocó disminuciones en estos resultados en ratones βENaC-Tg adultos y neonatales y redujo la mortalidad del 37 % en los recién nacidos βENaC-Tg tratados con vehículo al 21 % en los tratados con MUC-031 ( p<0,05).
Conclusión MUC-031 es un mucolítico potente y de acción rápida que disminuye la obstrucción de las vías respiratorias por moco, disminuye la inflamación de las vías respiratorias y mejora la supervivencia en ratones βENaC-Tg. Estos datos proporcionan la justificación para los ensayos en humanos de MUC-031 en enfermedades pulmonares mucoobstructivas.
Abstracto
MUC-031, un nuevo fármaco mucolítico de tiol-sacárido, es potente y de acción rápida en ensayos de esputo basados en reología y mejora la obstrucción del moco, la inflamación de las vías respiratorias y la supervivencia en un modelo de ratón con enfermedad pulmonar mucoobstructiva http://bit.ly/3Z2UIVQ
Introducción
La mucosidad patológica ocluye las vías respiratorias para disminuir el flujo de aire y causar infección e inflamación de las vías respiratorias en múltiples enfermedades pulmonares mucoobstructivas crónicas, incluidas la fibrosis quística (FQ) y la EPOC [1, 2]. Los mecanismos importantes de la formación de moco patológico incluyen aumentos en la concentración de mucinas [3, 4] y polímeros no mucinosos (p.ej ADN), y aumentos en los enlaces cruzados de disulfuro de mucina causados por ácidos oxidantes generados por la actividad de las peroxidasas secretadas por neutrófilos en la inflamación crónica de las vías respiratorias. [5].
Los fármacos tiólicos tienen efectos mucolíticos porque rompen los puentes disulfuro entre las mucinas a través de un proceso químico de intercambio de tioles. [6]. También pueden eliminar especies reactivas de oxígeno para tener efectos antioxidantes. [7]. Se han formulado relativamente pocos fármacos tiólicos para administración por inhalación, la vía de administración preferida para lograr la mucólisis. El fármaco tiol inhalado más utilizado es la N-acetilcisteína (NAC), un fármaco cuya eficacia clínica está limitada por un efecto secundario de broncoconstricción. Los mecanismos de la broncoconstricción inducida por NAC incluyen su formulación hiperosmolar y el potencial para la generación de sulfitos cuando la cisteína es catabolizada por las aminotransferasas. [8]. Anteriormente, informamos que los carbohidratos se pueden funcionalizar con un grupo tiol para generar compuestos tiol-sacáridos con ventajas de potencia sobre NAC [5]. Además, debido a que las aminotransferasas no actúan sobre los carbohidratos, los tiol-sacáridos no generarán catabolitos de sulfito.
El taponamiento de moco de las vías respiratorias se reconoce cada vez más como una causa importante de obstrucción del flujo de aire en un espectro de enfermedades pulmonares crónicas más allá de la FQ. Por ejemplo, la identificación y puntuación de tapones de moco en tomografías computarizadas de pulmón de pacientes con EPOC y asma reveló grandes subgrupos de pacientes con puntuaciones altas de tapones de moco que se asociaron fuertemente con medidas de obstrucción del flujo de aire. [9, 10]. Hay pocas opciones de fármacos mucolíticos para estos pacientes. Aunque la desoxirribonucleasa I humana recombinante (rhDNasa) y la solución salina hipertónica son eficaces en pacientes con FQ [11–13]no han demostrado eficacia en la EPOC ni en las bronquiectasias [14–17]y existe una gran necesidad insatisfecha de un mucolítico eficaz y bien tolerado para la EPOC y otras enfermedades pulmonares mucoobstructivas.
MUC-031 es un novedoso mucolítico de tiol-sacárido desarrollado como parte de una subvención de proyecto de programa traslacional financiado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre [18]. Se puede probar la eficacia de fármacos mucolíticos como MUC-031 in vitro usar un reómetro de cono y placa para cuantificar las propiedades elásticas y viscosas del esputo antes y después del tratamiento farmacológico, y en vivo en modelos animales de enfermedad pulmonar muco-obstructiva. Los ratones que sobreexpresan la subunidad β del canal de sodio epitelial en sus vías respiratorias (βENaC-Tg) desarrollan características clave de la enfermedad pulmonar mucoobstructiva, que incluye taponamiento de mucosidad de las vías respiratorias, inflamación de las vías respiratorias y mortalidad temprana [19–21]. Aquí nos propusimos usar la reología para determinar si MUC-031 es un mucolítico más potente que la rhDNasa y la NAC. Además, probamos si MUC-031 disminuye el taponamiento de moco y la inflamación de las vías respiratorias y mejora la supervivencia en ratones βENaC-Tg.
Métodos
Los detalles clave sobre los métodos experimentales se proporcionan aquí y los detalles adicionales se presentan en el material suplementario.
Síntesis de MUC-031
Hemos propuesto carbohidratos modificados con tiol (“tiol-sacáridos”) como nuevos mucolíticos a base de tiol debido a su eficacia y propiedades fisicoquímicas favorables para la administración por inhalación. [5]. Los andamios de carbohidratos son naturales y no tóxicos, y su naturaleza polar y su alta solubilidad en agua facilitan la penetración en los geles de mucina glicosilada. Además, la abundancia de grupos hidroxilo y centros quirales en los andamios de carbohidratos permite muchas posibilidades para la introducción de un grupo tiol y posteriores estudios de relación estructura-actividad. Por ejemplo, hemos demostrado que la introducción de un grupo tiol en la posición 6 de la galactosa genera un tiol sacárido (metil 6-tio-6-desoxi-α-d-galactopiranósido) con mejor actividad mucolítica que NAC [5]. Metil 6-tio-6-desoxi-α-d-galactopiranósido y MUC-031 son parte de una biblioteca de ∼30 tiol-sacáridos sintetizados por el Centro de Síntesis y Biología Química del University College Dublin (Dublín, Irlanda) utilizando enfoques de química sintética similares a los descritos previamente para el metil 6-tio- 6-desoxi-α-d-galactopiranósido [5]. Se han descrito estructuras representativas adicionales en la literatura de patentes. [22, 23]. MUC-031 fue elegido como el tiol-sacárido para un mayor desarrollo clínico por parte de los investigadores de la subvención del proyecto del programa traslacional por razones relacionadas con su potencia mucolítica y la estabilidad de la solución. Una vez seleccionado como líder, se realizó la síntesis a gran escala de MUC-031 en Cascade Chemistry (Eugene, OR, EE. UU.).
Participantes del estudio
El esputo inducido se recogió de controles sanos utilizando un protocolo de inducción de 12 minutos descrito anteriormente [24]. Se recolectaron muestras de esputo expectorado espontáneamente de pacientes adultos con FQ de acuerdo con los protocolos y los procedimientos de consentimiento informado aprobados por el comité de investigación humana de la Universidad de California, San Francisco (San Francisco, CA, EE. UU.). Las características demográficas y clínicas de los participantes del estudio se muestran en tabla 1.
Características demográficas y clínicas de controles sanos y pacientes con fibrosis quística (FQ) que donaron esputo para estudios de reología
Reología del esputo
Los módulos elástico (G′) y viscoso (G′′) del esputo se midieron utilizando un reómetro de cono y placa (dispositivos AR-2000 y DHR-2; TA Instruments, New Castle, DE, EE. UU.) [5]. Los métodos detallados se proporcionan en el material suplementario. Brevemente, se examinaron alícuotas de esputo en un modo de tensión controlada mediante la oscilación de la geometría del cono a una tensión del 5 % y midiendo el par. Después de completar las mediciones de la línea de base, se elevó la geometría y se añadió la solución del compuesto de prueba y se mezcló con el esputo. Las mediciones de oscilación cronometradas se tomaron repetidamente a intervalos de 2 min durante ≥30 min (figura 1a y B). Para acomodar la variabilidad inicial en el esputo G′ y G′′, se estimó un modelo de coeficiente variable a través de un marco de modelado aditivo generalizado (GAM). Cada muestra analizada es tratada de forma independiente por GAM, incluidas alícuotas separadas del mismo donante. El modelo genera un término suave, βj, en función del tiempo, que se denomina G’ normalizado o G” normalizado. En los experimentos iniciales, notamos que la adición de PBS al esputo de CF disminuyó los valores de G ‘y G’ ‘. Las muestras de esputo en las que se compararon los efectos mucolíticos de MUC-031 y NAC se trataron con un cóctel de inhibidores de proteasa (Halt; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y EDTA, pero las muestras de esputo en las que se compararon los efectos mucolíticos de MUC-031 y rhDNase se compararon no fueron tratados con inhibidores de la proteasa, porque estos inhibidores podrían disminuir la actividad de la rhDNasa dependiente de magnesio/calcio.
Efecto de la desoxirribonucleasa humana recombinante (rhDNasa), N-acetilcisteína (NAC) y MUC-031 sobre la elasticidad del esputo de pacientes con fibrosis quística (FQ). a) Esquema de un reómetro de cono y placa. Los módulos elástico (G′) y viscoso (G′′) se calculan a partir de la respuesta medida de las muestras al desplazamiento angular oscilante. b) Esquema del protocolo para probar la eficacia mucolítica de MUC-031, rhDNase y NAC. Los módulos G′ y G′′ de las muestras de esputo FQ se miden al inicio del estudio en un barrido de frecuencia de 0,1 a 50 Hz con una tensión del 5 %, seguido de la adición y mezcla manual de los agentes de prueba al 10 % v/w (control PBS, rhDNasa, NAC y MUC-031). c) Comparación del efecto mucolítico del control PBS (n=15), rhDNasa (n=15, 20 µg·mL−1) y MUC-031 (n = 15, 5 mM), en esputo no tratado con inhibidores de la proteasa, medido por el cambio en G ‘durante 30 min y analizado usando un marco de modelado aditivo generalizado (GAM). d) Porcentaje de muestras en cada grupo (PBS, rhDNasa y MUC-031) en función del tiempo en el que la G′ normalizada por GAM disminuye un 50 %. e) Comparación del efecto mucolítico del control PBS (n=8), NAC (n=16, 2,5 mM) y MUC-031 (n=16, 2,5 mM), en esputo tratado con inhibidores de la proteasa Halt y EDTA, medido por cambio en G′ durante 30 min y analizado por GAM. f) Porcentaje de muestras en cada grupo (PBS, NAC y MUC-031) en función del tiempo en el que G′ normalizado por GAM se reduce en un 50 %. En c) ye), las líneas continuas representan las estimaciones del modelo para βj (denominado G′ normalizado); los tonos más claros circundantes indican intervalos de confianza puntuales del 95 % a lo largo del transcurso del tiempo. Las líneas que no se superponen y los colores circundantes son indicativos de diferencias estadísticamente significativas entre las condiciones. *: p<0,05, **: p<0,01, ****: p<0,0001 para comparación de curvas acumuladas para MUC-031 versus rhDNasa, NAC o PBS.
estudios con animales
Todos los estudios con animales fueron aprobados por la autoridad de bienestar animal responsable de Charité – Universitätsmedizin Berlin (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, Berlín, Alemania). Los estudios de tratamiento se realizaron en ratones βENaC-Tg y compañeros de camada de tipo salvaje en el fondo de la cepa C57BL/6N [19, 25]. MUC-031 (131 mg·mL−1) o vehículo solo se aplicó por instilación intratraqueal (ratones adultos) o instilación intranasal (ratones neonatos) en un volumen de 1 µL·g−1 peso corporal. Para determinar los efectos del tratamiento agudo y crónico de MUC-031 en la enfermedad pulmonar mucoobstructiva establecida, se trataron ratones adultos βENaC-Tg y de tipo salvaje tres veces en 1 día o dos veces al día durante 2 semanas. Para determinar los efectos del tratamiento preventivo, se trataron ratones βENaC-Tg neonatales y de tipo salvaje desde el primer día de vida dos veces al día durante 2 semanas.
Recuento de células de lavado broncoalveolar y mediciones de citoquinas
El lavado broncoalveolar (BAL) fue…
