Resumen
Antecedentes
La transición epitelial -mesenquimal (EMT) se considera un proceso clave en la reparación del epitelio de las vías respiratorias después de la lesión. Forkhead Box C2 (FOXC2) es un factor de transcripción involucrado en el proceso EMT, si está involucrado en la reparación del epitelio bronquial, sigue siendo desconocido.
Métodos
Los ratones C57BL/6 se sometieron a inyección intraperitoneal con naftaleno (NAPH; 200 mg/kg) para inducir el modelo de lesión en las vías respiratorias. Se realizaron ensayos de inmunohistoquímica QPCR, inmunotransferencia y FOXC2 para detectar la expresión de FoxC2 en el epitelio bronquial. Para explorar la función de FOXC2 en la lesión de las vías respiratorias inducidas por NAPH, los ratones recibieron administración intratraqueal de partículas de lentivirus shfoxc2 o shnc, seguidas de tratamiento con NAPH. Se usó tinción de hematoxilina y eosina para evaluar la histopatología del epitelio bronquial. Análisis de inmunofluorescencia de CCSP, un marcador de células del club confirmó la expresión de CCSP en el epitelio bronquial. Los ensayos de inmunotransferencia e inmunofluorescencia determinaron la expresión de E-cadherina, vimentina y N-cadherina. En las células epiteliales bronquiales primarias de ratón (PBEC), sobreexpresamos y silenciamos a FoxC2 por partículas de lentivirus, respectivamente. La migración celular se analizó mediante un ensayo de curación de heridas. Los ensayos de inmunotransferencia determinaron la expresión de E-cadherina, vimentina, FN-EDA en PBEC inducidas por TGF-β1. La secuenciación de ARNm (MRNA-seq) y la secuenciación de chips FoxC2 (ChIP-seq) para revelar los genes aguas abajo de FoxC2 en PBEC inducidas por TGF-β1. El ensayo de luciferasa, los experimentos de CHIP-PCR y de rescate funcional se realizaron para confirmar la interacción de la proteína 1 de unión a Foxc2/formina (FNBP1) en PBEC inducidas por TGF-β1.
Resultados
La expresión de FOXC2 estaba regulada en los tejidos pulmonares de ratones a los 2, 3 y 6 días después del naf. La eliminación de FoxC2 en el epitelio bronquial de ratones retrasó la regeneración de células CCSP+ Club y la reparación normal del epitelio de las vías respiratorias dentro de los 14 días posteriores a la lesión. La eliminación de FoxC2 aumentó E-cadherina pero disminuyó la vimentina y la N-cadherina, los marcadores EMT durante la fase temprana después de la lesión. In vitro, la eliminación de FOXC2 endógeno reprimió la migración de las células y aumentó el E-cadherina inducida por TGF-β1 pero disminuyó la vimentina, N-cadherina y FN-EDA. La adición exógena de FoxC2 ejerció efectos opuestos. Además, MRNA-seq y Foxc2 chip-seq revelaron que FNBP1 podría ser un objetivo aguas abajo de FoxC2. La sobreexpresión de FNBP1 invirtió el papel inhibitorio de la caída de FoxC2 en EMT.
Conclusiones
Estos datos resaltan la función importante de FOXC2 como regulador en la reparación del epitelio bronquial después de la lesión.
Abstracto gráfico
Introducción
El epitelio de las vías respiratorias juega papeles fundamentales en la defensa contra los alérgenos, patógenos y contaminantes en el aire. La remodelación de las vías respiratorias caracterizada por cambios estructurales se produce por lesión epitelial y reparación en enfermedades pulmonares crónicas que incluyen fibrosis pulmonar, asma y enfisema (1, 2). Explorar el mecanismo molecular de la reparación de epitelio defectuoso en la remodelación de las vías respiratorias es de tremenda importancia para la prevención o el tratamiento de enfermedades pulmonares crónicas.
Naftaleno (NAPH) es un tóxico agudo, que causa daño en las vías respiratorias durante un corto período de tiempo (3). Las células del club son un tipo de células epiteliales secretoras que se encuentran en el epitelio bronquial. En enfermedades pulmonares crónicas, las células del club contribuyen a la reparación después de la lesión del epitelio por autorrenovación y diferenciación (4). En la lesión inducida por NAPH en ratones, las células del club vacuolar se mueren y exfolian inmediatamente a las 24 h. Las células sobrevivientes tienen una gran responsabilidad de la reparación de las vías respiratorias. La migración celular obviamente se incrementa a los 2-3 días después de la lesión debido a una transición epitelial -mesenquimal morfológica (EMT). La diferenciación celular ocurre a los 6-7 días después del naf. A los 14 días después de la lesión, la lesión es en gran medida completa (3, 5). Sin embargo, los mecanismos moleculares de la reparación del epitelio bronquial no han sido elaborados.
Forkhead Box C2 (FOXC2) es miembro de la familia Fox Transcription Factor, que participa en múltiples procesos biológicos, incluida la migración celular y la regeneración de tejidos. En enfermedades humanas, FOXC2 controla el desarrollo del proceso de la enfermedad a través de varios mecanismos, incluida la EMT y la migración celular (6,7,8). También hay evidencia de que la eliminación de FOXC2 agrava la isquemia/daño intestinal inducido por la reperfusión (9). Se ha encontrado que FOXC2 en las células tubulares lesionadas activa (10). En el desarrollo del pulmón, la eliminación de FoxC2 provoca la diferenciación aberrante de las células epiteliales alveolares (11). Sin embargo, la función de FOXC2 en el epitelio bronquial en respuesta a una lesión inducida por NAPH sigue siendo desconocida.
En el estudio actual, encontramos que FOXC2 se expresa altamente en el epitelio bronquial de ratones con exposición a NAPH. La eliminación de FoxC2 provoca una reparación defectuosa del epitelio bronquial in vivo. Los estudios in vitro sugieren que FOXC2 mejora las respuestas de la herida epitelial utilizando células epiteliales bronquiales primarias de ratón (PBEC). La secuenciación de ARNm (ARNm-seq) y la secuenciación de ChIP (ChIP-seq) y los ensayos funcionales relacionados revelan que la proteína de unión a formina 1 (FNBP1) puede ser un objetivo aguas abajo de FoxC2. FNBP1, un miembro de la familia de proteínas F-bar, se ha documentado para influir en la supervivencia celular, EMT y migración (12,13,14). Una expresión regulada negativa de FNBP1 en respuesta a FOXC2 indicó que FOXC2 a través de FNBP1 podría desempeñar un papel clave en la reparación de heridas epiteliales bronquiales. Nuestros datos destacan que FOXC2 es un factor de transcripción clave involucrado en la reparación de heridas epiteliales bronquiales mediante la regulación de la transcripción FNBP1.
Materiales y métodos
Construcciones de plásmidos y shrna
The cDNA encoding Mus FNBP1 (NM_001177648), or cDNA encoding Mus FOXC2 (NM_013519), or FOXC2 shRNA−1 (5′-CCTACAACATGTTCGAGAATG-3′), or FOXC2 shRNA−2 (5′-CCTTCTACCGCGAGAACAAGC-3′) was amplified and then inserted en el vector PLVX-IRES-PURO o el vector PLVX-SHRNA1 (Fenghui Shengwu, Changsha, China). Para la producción de lentivirus, el vector junto con el envasado lentiviral Vector PSPAX2 y el vector PMD2.G (Fenghui Shengwu, Changsha, China) se co-transfectaron en células HEK293T (Cellverse, Shanghai, China) usando reagente de transfección de lipofectamina 3000 (Invitrogen, CA, CA,). El lentivirus se cosechó 48 hy 72 h después de la transfección.
Inducción y tratamiento de lesiones epiteliales de las vías respiratorias
Un total de 120 ratones C57BL/6 hembra de ocho semanas de edad se mantuvieron en jaulas de ratón adecuadas con acceso libre a alimentos y agua durante 1 semana antes del experimento. El protocolo experimental de animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de la Universidad Médica del Hospital de Medicina Shengjing (número de aprobación: 2024PS116K).
Naph (CAS número 91–20-3) se adquirió de Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd (Shanghai, China). Se realizó una lesión epitelial de las vías respiratorias inducidas por NAPH en ratones C57BL/6 de acuerdo con el método de Gorissen et al. (5). Los ratones en el grupo NAPH fueron sometidos a inyección intraperitoneal de 200 mg/kg de naf en aceite de maíz. Los ratones de control se inyectaron con aceite de maíz. A los 1, 2, 3, 6 y 14 días después de la inyección de nafas, se cosecharon los tejidos pulmonares para su análisis. Para los experimentos in vivo, los experimentos se lograron con N = 6 animales aleatorios por grupo.
Para explorar el papel de FOXC2 en la reparación de lesiones de las vías respiratorias, la tráquea del ratón se expuso haciendo una incisión cervical bajo anestesia, los ratones estaban intratrachealmente infectados de partículas lentivirales (3 × 106 Tu) 3 días antes del tratamiento con nafas. A los 3, 6 y 14 días después del tratamiento con NAPH, se recolectaron tejidos pulmonares para ensayos posteriores.
Histopatología de tejidos pulmonares
Las muestras de tejido pulmonar se fijaron en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C. Los tejidos se incrustaron en parafina, se seccionaron en secciones de 5 μm de espesor y se tiñeron con hematoxilina (Solarbio, Beijing, China) y eosina (Sangon, Shanghai, China). Los resultados de la tinción se observaron con una microscopía Olympus DP73 (Olympus, Tokio, Japón; aumento, × 200).
Inmunohistoquímica
La expresión de FOXC2 en tejidos pulmonares se detectó mediante un ensayo de inmunohistoquímica estándar. La solución de reparación de antígeno se colocó en un recipiente resistente al calor y se calentó en el horno de microondas hasta que hirviera. Luego, las muestras preparadas se colocaron en la solución de reparación de antígeno y se calentaron durante 10 minutos para la reparación del antígeno. Después de la recuperación del antígeno, la incubación del 3% de H2O2 y la incubación de BSA al 1%, las secciones se inmunotinaron con anticuerpo de ratón FoxC2 (1: 100; Bios, Beijing, China) durante la noche a 4 ° C. La incubación del anticuerpo secundario (IgG anti-conejo de cabra marcado con HRP; 1: 200; Sangon, Shanghai, China) se realizó durante 1 ha temperatura ambiente. El color se desarrolló utilizando el cromógeno de diaminobencidina (DAB; Solarbio, Beijing, China) y se logró el contratinte de los núcleos con hematoxilina. Las imágenes de tinción fueron capturadas por una microscopía Olympus DP73 (aumento, × 400).
Inmunofluorescencia
Para la tinción de inmunofluorescencia individual de tejidos pulmonares, las secciones pulmonares se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario de proteína secretora de células de club (CCSP) (1:50; Santa Cruz, CA, EE. UU.) A 4 ° C. Las secciones del pulmón se incubaron luego con anticuerpo secundario IgG anti-ratón (1: 200; CST, MA, EE. UU.) Durante 1 h. Para la tinción de PBEC de inmunofluorescencia individual, las células se sembraron en portaobjetos de vidrio en una placa de cultivo celular, y las células fijas con paraformaldehído al 4% se incubaron durante la noche con anticuerpo primario de vimentina (1: 100; afinidad, Changzhou, China) a 4 ° C. Las rodajas celulares se incubaron con anticuerpo secundario IgG anti-conejo (1: 200; CST, MA, EE. UU.) Durante 1 h. Para la tinción de inmunofluorescencia doble, las secciones pulmonares se incubaron con anticuerpos primarios anti-CCSP (1:50; Santa Cruz, CA, EE. UU.) Y anti-vimentina (1: 100; afinidad, Changzhou, China) o anti-N-cadherina (1: 100; afinidad, Changzhou, China). Se usaron los anticuerpos secundarios IgG anti-conejo e IgG anti-ratón (1: 200; CST, MA, EE. UU.) Y el tiempo de incubación fue de 1,5 h. DAPI (Aladdin, Shanghai, China) se utilizó para contrarrestar. Todos los portaobjetos se montaron en microscopía y se analizaron los resultados de la tinción …
(Tagstotranslate) Naph (T) Reparación de la vía aérea (T) Transición epitelial -mesenquimal (T) FoxC2 (T) FNBP1 (T) Sistema de neumología/respiratorio
