Resumen
El ácido clorhídrico es uno de los productos químicos más frecuentes y peligrosos. Los derrames accidentales ocurren en plantas industriales o durante el transporte. La exposición al HCl puede provocar graves problemas de salud, incluidas enfermedades pulmonares agudas y crónicas. Anteriormente hemos descrito los aspectos moleculares, estructurales y funcionales del desarrollo de lesión pulmonar crónica y fibrosis pulmonar causada por la instilación intratraqueal de HCl en ratones. Aunque los modelos de ratón de enfermedades humanas tienen muchas ventajas, los roedores están evolutivamente lejos de los humanos y exhiben diferencias anatómicas y fisiológicas significativas. Las similitudes genéticas y anatómicas entre conejos y humanos son significativamente mayores. Los modelos en conejos de lesión pulmonar inducida por HCl se han utilizado escasamente para evaluar la lesión pulmonar aguda. En este estudio, por primera vez, utilizamos conejos como modelo de fibrosis pulmonar inducida por HCl y lesión pulmonar crónica. Presentamos evidencia molecular, histológica y funcional que demuestra la utilidad de utilizar este modelo para estudiar nuevos fármacos contra la fibrosis pulmonar.
Introducción
La inhalación aguda de vapores de HCl puede provocar neumonitis química y síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), afecciones caracterizadas por inflamación pulmonar inmediata y dificultad para respirar, como se observa en numerosos informes de casos (1,2,3,4). La inhalación a largo plazo es particularmente preocupante, ya que los estudios indican un mayor riesgo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) entre las personas expuestas a nieblas ácidas (5). La exposición crónica, incluso a niveles bajos de HCl, puede inducir afecciones respiratorias progresivas como bronquitis y fibrosis pulmonar, lo que sugiere una relación dosis-respuesta entre la concentración de HCl y la morbilidad respiratoria.6). La fisiopatología de la lesión pulmonar inducida por HCl implica daño directo al epitelio alveolar y al endotelio capilar, lo que conduce a un aumento de la permeabilidad vascular, edema e inflamación. La lesión pulmonar crónica a menudo resulta en fibrosis pulmonar progresiva, caracterizada por la acumulación de fibroblastos y miofibroblastos, lo que lleva a un depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular y al endurecimiento del tejido pulmonar.7). Estos mecanismos se dilucidaron en modelos de roedores utilizando ratones, ratas y cobayas (8,9,10,11,12). A pesar de las ventajas de estos modelos, las similitudes en la estructura de las vías respiratorias y la respuesta inflamatoria entre conejos y humanos son más fuertes y enfatizan la utilidad de los conejos en el estudio de los mecanismos subyacentes de las enfermedades pulmonares y en la formulación de intervenciones terapéuticas.13, 14). Las respuestas inflamatorias exhibidas por los modelos de conejo, particularmente en casos de asma, se parecen mucho a las observadas en humanos.15). Durante los últimos 30 años, varios estudios han examinado los efectos tempranos de la exposición al ácido clorhídrico en los pulmones de conejos, centrándose en la lesión pulmonar aguda (16,17,18).
En este estudio, desarrollamos un nuevo modelo de conejo para la lesión pulmonar crónica y la fibrosis pulmonar que incluye un período de observación relativamente largo y altas tasas de supervivencia. Este modelo podría resultar beneficioso para quienes estén interesados en las lesiones pulmonares inducidas por sustancias químicas y en el descubrimiento de fármacos para la fibrosis pulmonar.
Materiales y métodos
Materiales
El ácido clorhídrico (37%), el grado ACS, el cloruro de metacolina grado USP, el tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) y el cóctel inhibidor de proteasa se obtuvieron de Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, Estados Unidos). AnaSed (xilazina) grado USP, Ketaset (ketamina) grado USP y buprenorfina se obtuvieron de Covetrus (Portland, ME, Estados Unidos). El reactivo de formaldehído ACS, 37 %, se adquirió de ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, Estados Unidos), el kit de ensayo de proteína BCA de Pierce Co. (Rockford, IL, Estados Unidos) y EDTA de GE Healthcare (Chicago, IL, Estados Unidos). Estados). Los anticuerpos CD163 y HSP90 se obtuvieron de ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, Estados Unidos).
Animales y grupos de tratamiento.
Se anestesiaron por vía intramuscular conejos blancos de Nueva Zelanda, tanto machos como hembras, que pesaban entre 1,5 y 2,5 kg, con ketamina (20 a 50 mg/kg) y xilazina (3 a 5 mg/kg). Después de confirmar que la anestesia era adecuada mediante la ausencia de reflejos dolorosos, se colocó al animal en decúbito dorsal. Se afeitó el cuello y se lavó dos veces con alcohol. Se administró una única inyección subcutánea (sc) de buprenorfina (0,12 mg/kg) como analgesia. Esto fue seguido por un bolo de solución salina estéril de 10 a 12 ml/kg administrado por vía subcutánea para hidratar al animal y una exposición a 1,5 L/min de oxígeno al 100% durante 10 minutos. Luego se insertó una aguja de 25 G entre anillos traqueales consecutivos para pasar a través de ella un catéter de plástico de 2 pulgadas de largo; después de lo cual, se retrajo la aguja. Se inyectó rápidamente solución salina (1,5 ml/kg) o HCl 0,1 N (1, 1,5 o 2 ml/kg) a través del catéter y se lavó con 4 ml/kg de aire. Luego se retiraron el catéter y la aguja, se colocó al conejo en decúbito esternal y se le administró oxígeno al 100 % a través de una mascarilla. El flujo de oxígeno se redujo en 0,5 L/min aproximadamente cada 10 a 15 min. Una vez en aire ambiente y manteniendo una saturación de SPO2 superior al 90% durante aproximadamente 10 minutos, el animal se trasladó de la mesa de procedimiento a la jaula de recuperación.
Los conejos se dividieron aleatoriamente en seis grupos de tratamiento: (1) conejos machos expuestos a solución salina normal (VEH); (2) conejos macho expuestos a HCl 0,1 N a una dosis de 1 ml/kg; (3) conejos macho expuestos a HCl 0,1 N a una dosis de 1,5 ml/kg; (4) conejos macho expuestos a HCl 0,1 N a una dosis de 2 ml/kg. Los animales se sometieron a recolección de líquido de lavado broncoalveolar (BALF), análisis de tejido pulmonar (transferencia Western, qPCR en tiempo real), mediciones de la función pulmonar (FlexiVent) y análisis histológico a los 4, 10 y 60 días después de la exposición. Debido a las altas tasas de mortalidad, los estudios histológicos, BALF y análisis de tejido pulmonar para el grupo 4 se realizaron solo 60 días después de la exposición por razones éticas. Se incluyeron conejas en el estudio después de optimizar las dosis de HCl; fueron expuestos a VEH (grupo 5) o 1,5 ml/kg de HCl 0,1 N (grupo 6). El diseño experimental se ilustra en la Fig. 1.
Figura 1Diseño experimental. A los conejos se les inyectó HCl o solución salina por vía intratraqueal el día 0. Se recogió y analizó líquido de lavado broncoalveolar (BALF) en un conjunto de animales (n = 7/grupo de tratamiento/punto temporal). Los estudios de función pulmonar (Flexi-Vent, n = 4–6/grupo de tratamiento/punto temporal) e histología (n = 7/grupo de tratamiento/punto temporal) se realizaron utilizando conjuntos separados de animales.
Imagen a tamaño completoCálculo de dosis de HCl y traducción a exposición humana.
Las dosis de 1, 1,5 y 2 ml/Kg de HCl 0,1 N corresponden a 3,58, 5,38 y 7,17 mg/Kg respectivamente, en conejos y a 1,19, 1,79 y 2,39 mg/Kg en humanos. La dosis depositada en humanos se calculó utilizando la ecuación. (1) como se describió anteriormente (19):
$$:{X}_{h}={X}_{a}{left(frac{{M}_{a}}{{M}_{h}}right)}^{( 1-b)}$$ (1)Donde, (:{X}_{h}) = dosis de fármaco en humanos normalizada a la masa corporal (μg/Kg); (:{X}_{a}) = dosis de fármaco animal por unidad de masa corporal (3,58, 5,38 o 7,17 mg/Kg); (:{M}_{a}) = masa corporal del animal (2,5 Kg); (:{M}_{h}) = masa corporal humana (70 Kg); (:b) = 0,67 para el modelo de traducción inhalada.
No existe un análisis preciso de la dosis-respuesta a la inhalación de HCl en humanos. Henderson y Haggard (20), sin embargo, revisaron y clasificaron los niveles de gas HCl según la concentración, el tiempo de exposición y sus síntomas relacionados en humanos, definiendo como “peligrosa y potencialmente mortal” una exposición breve a 2000 ppm. Considerando de 10 a 25 min como el tiempo esencial en el “mundo real” para que el personal despeje el área luego de un derrame de gas HCl, utilizando la Ec. (2), como se propone en (21), las dosis depositadas correspondientes son:
$$Depósito{d_{Dosis}} = left( {C: times :RMV: times :D: times :IF: times :DF} right): div BW$$ (2)Donde, C: concentración de sustancia en el aire (2000 ppm − 2,980 mg(:{L}^{-1})); RMV: volumen respiratorio minuto (6 L (:{min}^{-1})); D: duración de la exposición (10, 20 y 25 min); PC: peso corporal (70 Kg); IF: fracción inhalable (se supone que es 100% para un diámetro aerodinámico medio de masa (MMAD) inferior a 3–4 μm); DF: fracción depositada. Se asumió que la fracción depositada era del 40% en humanos (22). Por lo tanto, para una exposición de humanos de 10, 20 y 25 minutos a 2000 ppm de HCl, las cantidades depositadas son:
(:{Depositado}_{Dosis}) (10 min) = 1,02 mg/Kg
(:{Depositado}_{Dosis}) (20 min) = 2,04 mg/Kg
(:{Depositado}_{Dosis}) (25 min) = 2,55 mg/Kg
Estos valores están notablemente cerca de las dosis depositadas calculadas en nuestro modelo de exposición al HCl en conejos.
Líquido de lavado broncoalveolar (BALF) Número de glóbulos blancos y concentración de proteínas totales
La recolección de BALF implicó la instilación y posterior recuperación de 1x PBS estéril (10 ml) a través de una cánula de jeringa conectada con una punta de pipeta de 1000 µl, que corresponde al diámetro de la tráquea del conejo. La cantidad de glóbulos blancos (WBC) en el líquido se midió usando un hemocitómetro. Después de la centrifugación del líquido a 2500 x g durante 10 minutos, se recogió el sobrenadante para medir los niveles de proteína. La concentración de proteína total se evaluó utilizando un kit de ensayo de proteínas de ácido micro bicinconínico (BCA), siguiendo las pautas proporcionadas por el proveedor.
Histopatología, inmunohistoquímica y puntuación de fibrosis pulmonar.
Los animales fueron sacrificados con 120 mg/kg de pentobarbital iv, se les abrió el tórax y se fijaron los pulmones en formaldehído al 10%. Se cortaron secciones transversales medias de los tejidos pulmonares fijados con formalina y se incluyeron en parafina. Para identificar los lóbulos pulmonares, los más involucrados en el proceso patológico, se analizó cada lóbulo. A partir de estos bloques se obtuvieron secciones de 5 μm de espesor y se tiñeron con tinción tricrómica de Masson, anticuerpos monoclonales anti-HSP90β y anti-CD163. Se seleccionaron al azar veinte campos en cada diapositiva y se examinaron bajo 20× y 40×…
