Resumen
Introducción
El cóctel fibrótico (FC) es una combinación de mediadores pro-fibróticos y proinflamatorios que induce cambios fibróticos tempranos en los modelos de pulmón organotípicos. Presumimos que el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) solo induce un efecto pro-fibrótico similar a FC. Nuestro objetivo era comparar los efectos pro-fibróticos de TGF-β1 con FC en cortes pulmonares de precisión humana (PCLS).
Métodos
Las PCL del tejido pulmonar «sano» de pacientes con cáncer sometidos a cirugía (n = 7) se incubaron con TGF-β1, FC o control durante 72 h. Se evaluaron los marcadores de expresión génica para la diferenciación de miofibroblastos, la matriz extracelular (ECM), así como los receptores TGF-β (RT-QPCR). La expresión de proteínas ECM en lisados y sobrenadante se evaluó por ELISA e inmunofluorescencia.
Resultados
Encontramos que TGF-β1 aumentó significativamente la expresión génica de Acta2, Col1A1, CCN2 y VIM en comparación con el control, pero también en comparación con FC. FC mostró un aumento significativo de la metaloproteinasa de matriz (MMP) 7 y 1 en comparación con el control, mientras que el receptor 2 de TGF-β fue más bajo después de FC en comparación con TGF-β1 o control. FC o TGF-β1 mostraron una expresión de proteína de fibronectina similar en lisados y sobrenadantes, mientras que la expresión de proteína de colágeno tipo I en lisados fue significativamente mayor con TGF-β1 en comparación con el control.
Conclusiones
Nuestros hallazgos muestran que TGF-β1 induce cambios pro-fibróticos consistentes en las PCL después de 72 h. En comparación con TGF-β1, el tratamiento con Fc dio como resultado una reducción de la expresión génica del receptor 2-β TGF-β y aumentó la expresión de MMPS, potencialmente mitigando los efectos profibróticos tempranos. La selección de estímulos profibróticos específicos puede ser preferible dependiendo de la pregunta de investigación y el punto de tiempo de interés en los estudios de fibrosis pulmonar utilizando PCL.
Introducción
Las enfermedades pulmonares intersticiales (ILD) fibrosantes son un subconjunto de ILDS que puede presentarse con un fenotipo progresivo que conduce a la mortalidad temprana (1). La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es la forma más grave de fibrosis pulmonar sin inflamación, lo que resulta en la disminución rápida de la función pulmonar (2). La mayoría de las ILD se caracterizan por inflamación y fibrosis, lo que los convierte en objetivos cruciales para la terapia (3). Cada vez más, se reconoce que los rasgos tratables pueden ser más importantes para guiar el tratamiento que el diagnóstico específico de ILD en sí mismo (4). Para estrategias de tratamiento personalizadas, se necesitan modelos de investigación que permitan la investigación de patomecanismos específicos, incluidos los estímulos inflamatorios y fibróticos en combinación y por separado.
El patomecanismo molecular de la fibrosis pulmonar implica varios factores profibróticos, como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (5), ácido lisofosfatídico (LPA) (6, 7), y factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) (8), que favorecen una respuesta anormal de curación de heridas y el desarrollo de la fibrosis pulmonar (9). Estos mediadores influyen en la deposición de la matriz extracelular excesiva (ECM), la apoptosis celular deteriorada o el aumento de la senescencia, lo que contribuye a cicatrices sostenidas y progresión de fibrosis (10).
Los modelos organotípicos, incluidos las PCL, han proporcionado información valiosa sobre la interacción dinámica entre las células mesenquimales y el ECM (11), o sobre la diafonía entre los fibroblastos alveolares y las células epiteliales mediadas por el factor de crecimiento transformador beta 1 (TGF-β1) y la vía Wnt no canónica (12). La inducción de fibrosis en PCL humanas se ha optimizado por varias estrategias, incluida la adición de inhibidores de la metaloproteinasa de la matriz (MMP) a TGF-β1 para mejorar la deposición del colágeno (13), la combinación de TGF-β1 con lisado de plaquetas o trampas extracelulares de neutrófilos (14).
Alsafadi et al. Sugirió un cóctel fibrótico específico (FC), que combina TGF-β1 con dos mediadores profibróticos, PDGF y LPA, y una citocina pro fibrótica pero también inflamatoria, factor de necrosis tumoral (TNF), para reproducir los cambios fisiológicos observados en las etapas tempranas de la fibrosis pulmonar ((((15). La elección de los estímulos resultó del conocimiento actual sobre el mediador de fibrosis en la fibrosis pulmonar (5, 7, 16). En particular, los autores afirman que el papel de TNF en IPF sigue siendo entendido de manera incompleta (15). Entre todos los factores profibróticos, TGF-β1 y su vía de señalización representan el estímulo principal para la respuesta de reparación errónea y permanente en la fibrogénesis pulmonar (16). TGF-β1 es igualmente un mediador común en la fibrosis de otros órganos (17). En comparación con otros estímulos fibróticos, como PDGF, TGF-β1 promueve una mayor producción de ECM como se muestra en los péptidos de colágenos tipo I y tipo III (18). En PCLS, TGF-β1 aumenta la deposición de ECM y se ha utilizado para estudiar medicamentos antifibróticos (19).
La fibrosis inducida por FC en PCLS es utilizada por varios grupos de investigación, incluido el nuestro y ha llevado a un progreso notable en la investigación de fibrosis pulmonar que resulta en numerosas publicaciones (20,21,22,23,24). Comparación de la expresión génica en PCL estimuladas por FC con etapas de IPF, FC recapitula el 46% de los cambios in vivo observados en todas las etapas. De estos, el 11% se superpuso con la firma específica de la etapa 1 en IPF, lo que indica que las PCL tratadas con FC recapitula mejor los procesos moleculares que ocurren en IPF temprano (25).
Como limitación de este modelo, observamos como Alsafadi et al. que algunos donantes responden de manera diferente al FC (15). Esto es independiente de las características clínicas y posiblemente debido a susceptibilidades específicas o interindividuales específicas del tejido (15). Para minimizar los factores involucrados en las variaciones de respuesta al tratamiento, planteamos la hipótesis de que TGF-β1 solo puede inducir suficientemente algunos de los cambios fibróticos en las PCL. Este estudio comparó TGF-β1 con fibrosis inducida por Fc en un modelo de PCLS de tejido pulmonar humano de afirmación normal de pacientes con cáncer sometidos a cirugía.
Métodos
Generación de PCLS
Los tejidos pulmonares de control humano (n = 7) se recolectaron de las áreas pulmonares de cáncer de pulmón de aparición normal de pacientes sometidos a cirugía en el Hospital Universitario, IneSpital, Bern (aprobación ética KEK-BE_2024-01841). Todos los pacientes firmaron consentimiento por escrito de recolección de muestras previas. Las características y los diagnósticos de los pacientes se resumen en la tabla 1.
Tabla 1 Características del pacienteMesa de tamaño completoLos tejidos pulmonares (ca. 10 g) se procesaron para generar PCL (400 μm de espesor, ∅ 4 mm) para garantizar la homogeneidad y la reproducibilidad entre las réplicas, siguiendo protocolos estándar establecidos (22). Los PCL se trataron con FC (5 ng/ml de TGF-β1, 10 ng/ml de PDGF-AB, 10 ng/ml de TNF y LPA 5 µM) (15) o 5 ng/ml TGF-β1 solo en DMEM suplementado con 0.1% de FBS durante 72 h. Los PCL de control se trataron con medios y diluyentes de reactivos. El medio cambió todos los días. Se recolectaron PCL (4–6 muestras por donante) y sobrenadante para el análisis de proteínas y expresión génica. Mesa suplementaria 1 muestra el análisis realizado en cada muestra de donante.
Aislamiento de ARN y determinación del gen
ARNm total, la síntesis de ADNc reacciones de transcripción inversa y RT-QPCR se realizaron después de nuestro protocolo modificado previamente informado (22). La expresión génica de Acta2, FN1, Col1a1, Col3a1, CCN2, VIM, MMP7, MMP1, TGFBR1, TGFBR2 y B2M como la limpieza de la limpieza se cuantificaron mediante PCR en tiempo real con SyBr ™ Green Master Mix (#4385616, Thermo Fisher Scientific). Las secuencias de imprimación se muestran en la tabla suplementaria 2 (22, 26).
Aislamiento de proteínas
Los PCL se interrumpieron mecánicamente en TissuelelySer II (Qiagen) y se obtuvieron lisado de proteína después de protocolos anteriores (22). La proteína total se cuantificó mediante el ensayo de proteína Pierce ™ BCA (#23227, Thermo Fisher Scientific) y las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta el uso.
ELISA
La alfa 1 alfa 1 humana y la fibronectina humana se midieron en el lisado de sobrenadante y proteína de PCLS por el kit ELISA ( #DY6220-05 y #DY1918-05, respectivamente, sistemas de IND), después del protocolo del fabricante. La determinación de dilución para el control y las muestras tratadas se realizó antes del análisis total de la muestra. La cantidad total de colágeno tipo I (PG/ml) y fibronectina (Ng/ml) en el lisado de proteína (µg/ml) se evaluó dividiendo los valores de ELISA respectivos por el contenido total de proteína medido por el ensayo de proteína BCA.
Inmunofluorescencia
Las PCL fijas se inmunotinaron para el dominio de fibronectina EDA humana, con DAPI como contratinción, siguiendo protocolos publicados anteriormente (22). Los archivos LSM se procesaron en el paquete de procesamiento de imágenes Fiji V1.54F (ImageJ, EE. UU.), Y la densidad integrada (intde, en unidades arbitrarias, AU) se calculó posteriormente a partir de las áreas fluorescentes positivas de cada imagen para estimar la intensidad de fluorescencia, siguiendo la fórmula: Fn intden = muestra intden – Control negativo intden.
Análisis estadístico
Todos los resultados se muestran como media ± desviaciones estándar. Las comparaciones entre los grupos se evaluaron mediante medidas repetidas ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 10 (Insight Partners, EE. UU.). La significación estadística se suponía cuando p <0.05.
Resultados
TGF-β1 induce la expresión génica para marcadores fibróticos en PCLS
Los resultados revelaron que TGF-β1 aumentó significativamente la expresión génica del marcador de diferenciación de miofibroblastos Acta2 en comparación con el control (P <0.01) y Fc (P <0.05) (Fig. 1A). Además, los niveles de ARNm de componentes de ECM como el dominio adicional de fibronectina A (FN-EDA) (p <0.0001), el colágeno tipo I y III (col1a1 (p <0.0001), col3a1 (p <0.05)), el factor de crecimiento del tejido (CCN2) y la vimentina (VIM), fueron significativamente aumentadas en PCLS después de la adición de la adición de Tissue-Tisser de la adición de Tiss. Fc.
Fig. 1Expresión del marcador fibrótico en PCL tratados con un cóctel fibrótico (FC) o TGF-β1 solo. (A) Expresión génica del marcador de miofibroblastos Acta2, los marcadores ECM EDA-FN1, COL1A1, COL3A1, CCN2 y VIM, los genes de remodelación de ECM MMP7 y 1, y los receptores TGF-β TGFBR1 y R2 72 h después del tratamiento con FC o TGF-β1 solo. Los resultados del gen se presentan como expresión génica relativa (RGE) a la del gen de limpieza B2M y fueron …
(Tagstotranslate) Corte pulmonar de precisión (T) Cóctel fibrótico (T) Factor de crecimiento transformador Beta 1 (T) Modelo ex vivo (T) Marcadores fibróticos (T) Fibrosis pulmonar (T) IPF (T) Sistema de neumología/respiratorio
