Resumen
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar crónica caracterizada por la obstrucción y la inflamación de las vías respiratorias. Las infecciones pulmonares de Haemophilus influenzae (NTHI) no tipecibles son comunes en la EPOC, promoviendo exacerbaciones frecuentes y disminución de la función pulmonar acelerada. La relación con las respuestas inmunes y el NTHI son poco conocidos. Aquí, caracterizamos exhaustivamente el microbioma respiratorio y el micobioma de los pacientes mientras investigamos la dinámica microbiana y los cambios inmunes del huésped atribuibles a la actividad de asesinato de NTHI. Se inscribieron pacientes con EPOC leve a moderado que abarcan exacerbadores frecuentes e infrecuentes y voluntarios sanos (HV). La composición microbiana, la proteómica y la actividad de asesinato de NTHI se analizó utilizando líquido de lavado broncoalveolar (BALF). Además, los títulos de antígeno -anticuerpos en los patógenos de suero a EPOC se determinaron utilizando un ensayo multiplex. El análisis de abundancia diferencial reveló un enriquecimiento de actinobacterias y bacteroidetes en la BALF de los sujetos con EPOC y HV, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en la respuesta del título de IgA contra los antígenos NTHI en la EPOC vs. HV. En particular, también hubo una actividad de asesinato significativamente mayor contra NTHI en BALF de la EPOC frente a los sujetos de HV (OR = 5.64; IC 95% = 1.75–20.20; P = 0.001). La estratificación de los pacientes con EPOC por actividad de asesinato de NTHI identificó firmas de proteínas y microbianas únicas en las que firmes, las actinobacterias y la haptoglobina se enriquecieron en pacientes con actividad de asesinato. Reportamos que las diferencias en las respuestas inmunes del huésped y la actividad de muerte NTHI están asociadas con cambios en el microbioma en la EPOC leve a moderada. Esto sugiere un vínculo potencial entre el microbioma respiratorio y la actividad inmune contra el NTHI en el contexto de la patogénesis de la EPOC incluso en esta etapa de la enfermedad.
Introducción
La EPOC es una enfermedad pulmonar inflamatoria crónica caracterizada por patologías pulmonares heterogéneas y a menudo se asocia con comorbilidades sistémicas (1). La inhalación del humo del cigarrillo, los contaminantes del aire, las infecciones bacterianas recurrentes y los determinantes genéticos se encuentran entre las principales causas informadas (2, 3). A pesar de ser una de las principales causas de muerte en todo el mundo (4), los enfoques actuales de la terapia se centran principalmente en el manejo de los síntomas, para los cuales las terapias inhaladas están ampliamente empleadas (5). Además, el tratamiento a largo plazo con antibióticos para tratar etiologías infecciosas no es factible, ya que se complica por el desarrollo de resistencia antimicrobiana y eventos adversos. En cualquier caso, los antibióticos no han demostrado ser exitosos en la reducción de las hospitalizaciones o la mejora de la función pulmonar (6). La morbilidad de la EPOC también está influenciada por la frecuencia de las exacerbaciones, que a menudo son estacionales, y se caracterizan por un brote de los síntomas de la enfermedad generalmente en asociación con un evento infeccioso (7). Se han implicado exacerbaciones más frecuentes en acelerar la tasa de disminución de la función pulmonar en la EPOC (8).
El microbioma respiratorio se ha convertido en un importante contribuyente a la patogénesis de la EPOC y también se ha relacionado con el inicio de la exacerbación. La evidencia emergente sugiere que la disbiosis microbiana resultante de la persistencia y la proliferación de bacterias patógenas en el tracto respiratorio inferior puede superar los comensales e influir en los perfiles del huésped al desencadenar una respuesta inmune desregulada. Intuitivamente, la colonización con bacterias patógenas se ha asociado con una pérdida de diversidad microbiana (9), que a su vez conduce a una mayor susceptibilidad a la infección (10). De acuerdo con esta hipótesis, los cambios en la estructura de la comunidad de microbioma y la diversidad se han relacionado con los cambios transcriptómicos del host (11) y expresión de citocinas proinflamatorias como IL-8 en el esputo de los pacientes con EPOC (12).
Además, se han identificado taxones bacterianos enriquecidos diferencialmente en la enfermedad tanto en el esputo como en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) (BALF) (BALF) (BALF)12,13,14), y se han observado cambios en las composiciones de microbioma respiratorio durante las exacerbaciones. Si bien aún no se ha identificado una firma universal, la colonización persistente en las vías respiratorias inferiores con Haemophilus influenzae (NTHI) y Moraxella catarrhalis (MCAT) no tipicables se han asociado con una respuesta inflamatoria y una disminución de la función pulmonar progresiva tanto durante el estado estable como durante las exacerbaciones (15). En particular, se ha estimado que las especies de Haemophilus prevalecen en hasta el 70% de los pacientes con EPOC y se han relacionado constantemente con resultados clínicos más pobres (16,17,18,19).
Debido a la naturaleza multifactorial de la patogénesis de la EPOC y las exacerbaciones agudas, la investigación sobre enfoques novedosos como las vacunas y los anticuerpos monoclonales de acción prolongada están garantizadas para tratar a los impulsores infecciosos. En consecuencia, NTHI y MCAT han sido el foco de la orientación terapéutica en la EPOC, a menudo en combinación. La evidencia sugiere que ayudan a su existencia mutua al contrarrestar la muerte mediada por el complemento y promover una mayor resistencia a los antibióticos (20, 21). Las proteínas expuestas de la superficie conservadas de estos patógenos se han investigado como componentes de una vacuna múltiple adyuvante (tres antígenos de NTHI y un antígeno de MCAT) diseñada para reducir la tasa de exacerbaciones agudas en la EPOC moderada a severa en un estudio reciente de fase II. La vacuna tenía un perfil de seguridad y reactogenicidad aceptable consistente con un estudio anterior de fase I (22) y otro estudio de vacuna que solo usaba componentes NTHI (23). Desafortunadamente, esta vacuna no logró cumplir con su punto final de eficacia principal, enfatizando aún más la complejidad de este espacio (24, 25).
Aquí, hemos caracterizado exhaustivamente el paisaje del microbioma respiratorio y el micobioma en pacientes con EPOC versus voluntarios sanos (HV) a través de 16S rRNA y su secuenciación de muestras de BALF y esputo. Además, estudiamos el impacto de la dinámica microbiana en relación con las respuestas inmunes en pacientes con EPOC para comprender mejor el papel de la inmunidad protectora en la configuración de los resultados microbianos y clínicos en la enfermedad.
Métodos
Cohorte de pacientes y colección de muestras
Los detalles sobre la cohorte de pacientes se han informado previamente (26,27,28). Brevemente, los pacientes con EPOC leve a moderado que abarcan frecuentes (P-FE) y exacerbadores infrecuentes (P-II) y voluntarios sanos (HV) comprendidos por nunca fumadores (HV-NS) y ex fumadores (HV-ES) se reclutaron en nuestra cohorte como parte del estudio anualizado de Astrazeneca. Los pacientes con EPOC se clasificaron como P-Fe si tenían antecedentes de ≥2 exacerbaciones, o P-II si tenían antecedentes de ≤1 exacerbación en el año anterior antes de la inscripción, cuando las exacerbaciones podrían ser moderadas (requiriendo esteroides orales o antibiotics o ambos) o severos (requerir esteroides orales o antibioides o ambas personas en el hospital). Se ha demostrado que los eventos de exacerbación ≥2 son un predictor confiable de exacerbaciones futuras (29, 30). Los pacientes que informaron un evento de exacerbación en la inscripción anterior de un mes no se incluyeron en la cohorte. Además, los sujetos que usan cualquier fármaco de investigación antibacteriano, antiviral o respiratorio o vacuna relevante hasta 30 días antes de la visita de inscripción tampoco se incluyeron en la cohorte del estudio. Los ex fumadores habían dejado de fumar 6 meses antes de la inscripción y tenían al menos una historia de 10 años de paquete. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito, y el estudio fue aprobado por el Servicio Nacional de Ética de Investigación South Central – Comités de Hampshire A y Oxford C (LREC No: 15/SC/0528).
La broncoscopia de fibra óptica se usó para el muestreo del fluido de lavado broncoalveolar (BALF) que se ha descrito en detalle anteriormente (26). Las muestras de BALF se recogieron después de la inscripción inculcando 100 ml de solución salina en 2 lóbulos por paciente (Fig. S1). Se recuperó un blanco salino antes de la broncoscopia al enjuagar 20 ml de la misma preparación de solución salina a través del broncoscopio. Las muestras de esputo se obtuvieron mediante expectación espontánea o inducidas por inhalación de solución salina de acuerdo con los métodos estándar de todos los pacientes también en la entrada del estudio (26, 27, 31).
Expresión de antígenos de proteínas recombinantes para NTHI, M. catarrhalis y S. pneumoniae
Las secuencias para proteínas E, F, D P6 y PILA (NTHI), OMPCD, M35 y USPA2 (M. catarrhalis) y S. pneumoniae neumolisina se clonaron en pet28a. La producción de proteínas recombinantes etiquetadas con HIS se realizó en E. coli después de la inducción con IPTG. E. coli se lisó seguido de la purificación de proteínas de la fracción sobrenadante utilizando columnas de afinidad de níquel.
Medición serológica de títulos de anticuerpos para antígenos de NTHI, MCAT y Streptococcus pneumoniae
Los niveles séricos de IgG, IgA e IgM de sujetos sanos y pacientes con EPOC contra proteínas recombinantes derivadas de NTHI, MCAT y S. pneumoniae se midieron con un ensayo multiplex personalizado (descubrimiento de meso a escala; diagnóstico de meso a escala, Rockville, MD) a escala Mesa Discovery de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se desarrollaron dos placas de 10 puntos al recubrir con M35, CD OMP, PILA, proteína D, proteína E y proteína F o USPA2, P6 y neumolisina. Los puntos vacíos se cubrieron con albúmina de suero bovino. Las placas se bloquearon primero con 150 μl de bloqueador de MSD A durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) bajo 705 rpm de agitación. Después de 3 lavados con PBS/Tween al 0,1%, se incubaron 50 μl de cada suero a una dilución de 1: 100 en cada placa durante 2 ha RT mientras se agitaba a 705 rpm. After three washes, plates were incubated with 50 μL of sulfo tag-labelled anti-human IgG (clone Hytest 1G1, 2 μg/mL), sulfo-tag labelled anti-human/nonhuman primates IgA (clone D-20JJ-6, 2 μg/mL) or sulfo-tag labelled human/nonhuman primate IgM (D20JP-6, 1 μg/ml) durante 1 hora en RT. Después de 3 lavados, se detectaron anticuerpos específicos con 150 μl de MSD Gold ™ Leer Buffer A y placas leídas en un meso sector S 600 mm (descubrimiento de escala meso). IgG, IgA e IgM se cuantificaron utilizando tres sueros mezclados humanos con concentración arbitraria asignada …
(Tagstotranslate) COPD (T) Hemophilus influenzae n (T) Microbioma (T) Exacerbaciones (T) Sistema de neumología/respiratorio
