Abstracto
Fondo
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad pulmonar fibrótica mortal con pocas opciones terapéuticas eficaces. Recientemente, el reposicionamiento de fármacos, que implica identificar nuevos potenciales terapéuticos para fármacos existentes, se ha popularizado como un nuevo enfoque para el desarrollo de nuevos reactivos terapéuticos. Sin embargo, este enfoque aún no se ha utilizado completamente en el campo de la fibrosis pulmonar.
Métodos
El presente estudio identificó opciones terapéuticas novedosas para la fibrosis pulmonar utilizando un enfoque computacional sistemático para el reposicionamiento de fármacos basado en la integración de firmas de expresión génica pública de fármacos y enfermedades (enfoque de detección in silico).
Resultados
Entre los principales compuestos predichos como terapéuticos para la FPI mediante el enfoque in silico, seleccionamos BI2536, un inhibidor 1/2 de la quinasa tipo polo (PLK), como candidato para tratar la fibrosis pulmonar mediante un análisis in silico. Sin embargo, BI2536 aceleró la mortalidad y la tasa de pérdida de peso en un modelo experimental de fibrosis pulmonar en ratones. Debido a que la tinción de inmunofluorescencia reveló que la expresión de PLK1 era dominante en los miofibroblastos mientras que la expresión de PLK2 era dominante en las células epiteliales de pulmón, a continuación nos centramos en el efecto antifibrótico del inhibidor selectivo de PLK1 GSK461364. En consecuencia, GSK461364 atenuó la fibrosis pulmonar con una mortalidad y pérdida de peso aceptables en ratones.
Conclusiones
Estos hallazgos sugieren que dirigirse a PLK1 puede ser un enfoque terapéutico novedoso para la fibrosis pulmonar al inhibir la proliferación de fibroblastos pulmonares sin afectar las células epiteliales pulmonares. Además, si bien la detección in silico es útil, es esencial determinar completamente las actividades biológicas de los candidatos mediante estudios de validación de laboratorio húmedo.
Fondo
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad crónica devastadora caracterizada por la proliferación de fibroblastos, la acumulación excesiva de miofibroblastos y el depósito de matriz extracelular. [1] [2]. El pronóstico de la FPI es malo, con una mediana de supervivencia de aproximadamente dos a cuatro años después del diagnóstico. [3] [4]. La FPI ocurre en todo el mundo, y la prevalencia de esta enfermedad parece estar aumentando [5]. Aunque dos fármacos antifibtóticos, nintedanib y pirfenidona, están actualmente aprobados por la FDA para la FPI [6], su eficacia aún no es suficiente para los pacientes, ya que el beneficio se limita a inhibir la disminución de la función pulmonar. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos fármacos es muy deseable.
El proceso actual de investigación y desarrollo de fármacos implica la creación de un reactivo novedoso, la realización de estudios preclínicos y clínicos y la obtención de la aprobación para su comercialización a través del proceso de revisión de asuntos farmacéuticos. Sin embargo, el paradigma de descubrimiento de fármacos en la actualidad no solo es generalmente costoso y requiere mucho tiempo, sino que también tiene una tasa de éxito extremadamente baja de 1 en 20,000 a 30,000. [7].
Una forma de eludir este problema es identificar nuevos usos para los medicamentos existentes, lo que se conoce como “reposicionamiento de medicamentos”. Debido a que los medicamentos existentes tienen perfiles de seguridad y farmacocinética conocidos y, a menudo, están aprobados por las agencias reguladoras para uso humano, cualquier uso recién identificado puede evaluarse rápidamente en ensayos clínicos, que generalmente tienen un período corto y son económicos de realizar. [8] [9] [10]. Por lo tanto, el reposicionamiento de fármacos se está volviendo popular como un nuevo método para optimizar el proceso preclínico de desarrollo de nuevos fármacos, ahorrando tiempo y dinero en comparación con el proceso tradicional de descubrimiento de fármacos de novo. [11].
Recientemente, los datos biomédicos a gran escala y las bases de datos de medicamentos, como las firmas de expresión génica de micromatrices y las bases de datos farmacéuticas, también se han puesto a disposición del público junto con la computación de alto rendimiento, lo que permite el desarrollo de enfoques computacionales de reposicionamiento de medicamentos conocidos como detección in silico. [12] [13]. Sin embargo, se ha investigado muy poco sobre el uso efectivo del reposicionamiento de fármacos en el campo de la fibrosis pulmonar. Pocos informes han descrito la búsqueda de nuevos candidatos a fármacos mediante el cribado in silico [14] [15]y la mayoría de los que existen simplemente han identificado fármacos candidatos, sin validación de su eficacia real mediante estudios in vivo o in vitro.
Por lo tanto, en el presente estudio, no solo exploramos nuevos candidatos terapéuticos para la fibrosis pulmonar mediante un enfoque de detección in silico utilizando datos de múltiples fuentes y bioinformática de red molecular integradora, sino que también validamos el efecto antifibrótico de los candidatos en un modelo experimental de fibrosis pulmonar en ratones y estudio in vitro utilizando fibroblastos de pulmón y células epiteliales de pulmón. En consecuencia, descubrimos que un inhibidor de la cinasa tipo polo (PLK) seleccionado mediante los resultados combinados de los estudios de detección in silico y de validación en laboratorio húmedo mejoró la fibrosis pulmonar en modelos experimentales de fibrosis pulmonar en ratones.
Métodos
Los métodos detallados se describen en el suplemento en línea.
Análisis in silico
Los genes expresados diferencialmente (DEG) entre IPF y muestras normales se detectaron a partir de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO). Al ingresar datos DEG en el motor de búsqueda de firmas de dirección de características L1000 (L1000CDS2), buscamos un candidato terapéutico de FPI.
Aislamiento de células epiteliales primarias de pulmón murino
La purificación de células epiteliales de pulmón murino se realizó mediante agotamiento negativo con CD45 MicroBeads y selección positiva para la molécula de adhesión de células epiteliales (Ep-CAM), como se describió anteriormente. [16].
Ensayos de proliferación
Se sembraron fibroblastos pulmonares primarios murinos en placas de 96 pocillos y se cultivaron con diversas concentraciones de BI2536 o GSK461364 en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2) (30 ng/ml) o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ( 100 ng/ml) durante 48 h. Se sembraron células epiteliales de pulmón murino en placas de 96 pocillos y se cultivaron con diversas concentraciones de BI2536 o GSK461364 en presencia de FGF-2 (30 ng/ml) durante 48 h. Un microcurio por pocillo de [3H] timidina desoxirribosa se pulsó durante las últimas 24 h, y la incorporación de [3H] la timidina desoxirribosa se midió usando un contador de centelleo líquido [17].
Análisis de inmunotransferencia
Se lisaron extractos celulares de fibroblastos murinos y células epiteliales de pulmón y se usaron para inmunotransferencia, como se describió anteriormente. [18].
Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones
Se compraron ratones C57BL/6 de ocho semanas de Charles River Japan (Kanagawa, Japón). Los ratones recibieron una única instilación intratraqueal de bleomicina (3 mg/kg) el día 0. Se administró BI2536 (5 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg) dos veces por semana desde el día 0 hasta el día 21. GSK461364 (5 mg/kg) dos veces por semana desde el día 0 hasta el día 21. Los tejidos pulmonares se analizaron el día 21.
Histopatología
Se recogieron tejidos del pulmón derecho, se fijaron en formalina al 10% y se incluyeron en parafina. Las secciones de tres micrómetros de espesor se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) o Azan Mallory. En el análisis cuantitativo se utilizó una escala fibrótica numérica (puntuación de Ashcroft).
Ensayo colorimétrico de hidroxiprolina
Los contenidos de hidroxiprolina de los pulmones tratados con bleomicina se midieron utilizando un kit de ensayo colorimétrico de hidroxiprolina (BioVision).
Lavado broncoalveolar
Se realizó lavado broncoalveolar (BAL) con solución salina (1 mL) utilizando una cánula blanda. Después de contar el número de células en el fluido BAL (BALF), las células se tiñeron con Diff-Quick para la clasificación celular.
Tinción de inmunofluorescencia
Las secciones de pulmón embebidas en parafina se tiñeron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche y posteriormente se tiñeron con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia y 4′, 6-diamidino-2-fenilindol a temperatura ambiente durante 1 hora. Las imágenes de fluorescencia se capturaron con un microscopio de barrido láser confocal.
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
La cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCR) se realizó como se describió anteriormente [19].
Análisis estadístico
La importancia de las diferencias se analizó utilizando un t-prueba para comparaciones entre dos grupos, o un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba de Dunnett para…
