Resumen
Antecedentes
La sepsis es un insulto indirecto común que conduce al síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS). Se ha informado que las vesículas extracelulares circulantes (EV) participan en la patogénesis de la sepsis. Sin embargo, la alteración de S100A8/A9 unida a EV durante el shock séptico, junto con el papel de S100A8/A9 para impulsar la lesión pulmonar aguda, permanece inexplorada.
Métodos
Los EV se aislaron del plasma de los pacientes al ingreso con sepsis o shock séptico, así como de controles sanos. Los niveles de EV S100A8/A9 se analizaron a través de ELISA. Para examinar los efectos y los mecanismos subyacentes de los EV de choque séptico en la lesión pulmonar aguda, estos EV se administraron intratraquealmente en ratones o ratones C57BL/6 de tipo salvaje con una deficiencia de productos finales de glicación avanzados (RAGE). Además, se introdujo un modelo de ratón de sepsis polimicrobiana utilizando ligadura cecal y punción (CLP).
Resultados
Los niveles de EV S100A8/A9 se elevaron significativamente en pacientes con sepsis o shock séptico en comparación con los controles sanos. El análisis de la característica operativa del receptor (ROC) demostró que EV S100A8/A9 distinguía efectivamente entre shock séptico y sepsis y tenía un potencial predictivo para el desarrollo de ARDS. En particular, los niveles de S100A8/A9 en EV y macrófagos alveolares de ratones CLP fueron significativamente más altos que los de los ratones simulados. La administración intratraqueal de EV de choque séptico indujo directamente la lesión pulmonar aguda y la polarización de los macrófagos M1 de una manera independiente del lipopolisacárido. Los EV de choque séptico fueron absorbidos de manera eficiente por los macrófagos alveolares in vivo, lo que condujo a un aumento significativo en los niveles de S100A8/A9, que se inhibió preincubando los EV con un anticuerpo neutralizante S100A8/A9. Además, los ratones con deficiencia en RAGE, un receptor para S100A8/A9, estaban parcialmente protegidos de lesión pulmonar aguda inducida por EV de choque séptico. Los EV in vitro de choque séptico provocaron una respuesta proinflamatoria en los macrófagos derivados de la médula ósea. Esta respuesta se bloqueó preincubando los EV con el anticuerpo neutralizante S100A8/A9.
Conclusiones
Nuestros resultados sugirieron que EV S100A8/A9 tiene un valor potencial para distinguir el shock séptico de la sepsis y predecir el desarrollo de SDRA. La lesión pulmonar inducida por EVS de choque séptico está mediada al menos parcialmente a través de la vía de rabia S100A8/A9, lo que implica la activación de los macrófagos alveolares.
Fondo
El síndrome de angustia respiratoria aguda (ARDS, lesión pulmonar aguda) se caracteriza por el inicio agudo de la disnea refractaria que se acompaña de infiltrados bilaterales en la radiografía de tórax que no puede atribuirse a la insuficiencia cardíaca. A pesar de las estrategias de apoyo, como el bloqueo neuromuscular y la ventilación protectora pulmonar, la mortalidad del SDRA sigue siendo de alrededor del 30-40% (1). Durante la fase temprana de la lesión pulmonar, los macrófagos alveolares son activados por los patógenos a través de receptores de reconocimiento de patrones. Las citocinas proinflamatorias se liberan y estimulan la liberación de quimiocinas de las células epiteliales alveolares vecinas y los macrófagos de tejido, lo que resulta en el reclutamiento de neutrófilos y macrófagos. Las respuestas inflamatorias severas conducen a una función de barrera deteriorada del epitelio alveolar y la acumulación de líquidos en el espacio del aire (2).
Una de las principales causas subyacentes de ARDS es la sepsis (3). La sepsis es un síndrome letal caracterizado por la disfunción de órganos como resultado de la respuesta desregulada a la infección (4). Se estima que alrededor de 49 millones de pacientes en todo el mundo estaban afectados por sepsis en 2017, lo que representa aproximadamente 11 millones de muertes relacionadas con la sepsis y casi una quinta parte de todas las muertes globales anuales (5). En la actualidad, no existe un tratamiento específico para los SDRA inducidos por sepsis. Existe una necesidad apremiante de descifrar los mecanismos precisos de los SDRA inducidos por la sepsis.
Las vesículas extracelulares (EV) son partículas naturalmente secretadas de las células (6). Chargaff y West documentaron por primera vez la presencia de EV en 1946 como «Productos de desglose minuciosos de Blood Corpuscles» (7). La primera imagen de microscopía electrónica de EV se documentó en 1967 (8). EVS, originalmente pensados como una característica de la eliminación de residuos para las células (9), ahora representan un medio único para la comunicación intercelular (10, 11). Tienen la capacidad de imitar la función de las células parentales y transferir miRNA/ARNm funcional y cargos de proteínas a las células objetivo (12). Nuestro grupo informó que miR-27A-3p fue transportado desde EV de células madre mesenquimales a macrófagos alveolares y una lesión pulmonar disminuyendo (13).
La inyección intravenosa de EV de la sangre periférica de pacientes sépticos elevó significativamente la expresión de proteínas proinflamatorias como el factor nuclear-ĸb (NF-ĸB) en los pulmones y el corazón de los ratones (14). Li et al. informó que los EV de sepsis mejoraron las respuestas proinflamatorias y la apoptosis de las células relacionadas con el tejido pulmonar mediante el suministro de miR-210-3p (15). Xu et al. informó que los EV circulantes de ratones sépticos provocaron la producción de citocinas proinflamatorias in vitro a través de miRNA y señalización mediada por TLR7. Los EV también indujeron el reclutamiento de leucocitos peritoneales in vivo (16).
Se ha documentado que S100A8 y S100A9 existen como un complejo heterodímero y se expresan abundantemente en neutrófilos, macrófagos y células endoteliales, lo que representa hasta el 40% de las proteínas citosólicas de neutrófilos (17, 18). El complejo S100A8/A9 es un ligando para el receptor 4 (TLR4) y el receptor de toll-like (RAGE), promoviendo respuestas proinflamatorias (RAGE), promoviendo respuestas proinflamatorias (19). Plasma S100A8/A9 se ha informado como un marcador de enfermedad para la sepsis y un predictor para los resultados (20). El primer objetivo de este estudio fue examinar si hay una alteración de EV S100A8/A9 en pacientes con sepsis y shock séptico. El segundo objetivo era determinar si EV S100A8/A9 contribuye a la lesión pulmonar inducida por choque séptico.
Materiales y métodos
Sujetos de estudio
Los pacientes con sepsis y shock séptico se inscribieron consecutivamente en el estudio observacional prospectivo realizado en la UCI del primer hospital afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang entre septiembre de 2022 y mayo de 2024. Todos los pacientes inscritos cumplieron con la clasificación de consenso sepsis-3 (4). Los pacientes elegibles tenían al menos 18 años y se diagnosticaron con sepsis durante las primeras 24 h después del ingreso. Los sujetos fueron excluidos del estudio si se cumplieron alguno de los siguientes criterios: edad inferior a 18 años, embarazo, sometido a inmunosupresores o quimioterapia, enfermedades inflamatorias crónicas, infección actual de CoVID-19/VHB/VHC/VIH e lesiones cerebrales traumáticas. Los sujetos de control sano eran voluntarios de la edad sin infección concurrente y se inscribieron durante el examen físico. Después de la inclusión, todos los participantes o representantes legales recibieron detalles escritos del estudio. El estudio solo se realizó en participantes con consentimiento informado por escrito. Los procedimientos de estudio fueron en obediencia a las disposiciones detalladas en la Declaración de Helsinki. El protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética del primer hospital afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang. Para los sujetos inscritos, se recogió sangre periférica completa hasta 24 h después de la admisión de la UCI. En los controles sanos, se recolectó sangre periférica completa inmediatamente después del consentimiento informado por escrito. Características demográficas, causas de infección, resultados de microbiología, puntajes secuenciales de evaluación de insuficiencia orgánica (SOFA), fisiología aguda y evaluación de salud crónica II (Apache II), mediciones de laboratorio, desarrollo de SDRA, longitudes de estadía en el hospital y mortalidad por UCI del registro médico para el propósito del estudio.
Aislamiento y etiquetado de los vehículos eléctricos de plasma
Se recogieron muestras de sangre periférica en tubos EDTA y se centrifugaron a 800 g durante 10 minutos en 4 h de la recolección de muestras. Después de la centrifugación, las muestras de plasma se recolectaron y almacenaron cuidadosamente en un congelador -80 ° C hasta el uso. Las muestras de plasma se descongelaron y se colocaron en tubos de centrífuga SW 32 TI (Beckman Coulter, Brea, CA), diluido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la altura apropiada, y se centrifugaron a 10,000 g durante 30 minutos. Luego, la fracción superior se vertió en un nuevo tubo de centrífuga SW 32 TI y se centrifugó a 120,000 g durante 120 minutos. El sedimento de la centrifugación se lavó con 9 ml de PBS, se transfirió a un tubo de centrífuga SW 41 Ti y se centrifugó a un segundo 120,000 g durante 120 minutos. El sedimento que contiene EV se resuspendió con 50 µl de PBS. El rendimiento de EV se determinó midiendo el contenido de proteína utilizando el kit de detección de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher, Waltham, MA) (se proporciona una lista de reactivos comerciales en la mesa complementaria 1). Para el ensayo de transferencia de carga EV in vivo, el etiquetado de los EV con Vybrant ™ dID (Thermo Fisher) se realizó como se describió anteriormente (13).
Tabla 1 Características demográficas y clínicas de los pacientes con sepsis y shock sépticoMesa de tamaño completoPara la visualización de la carga de EV transferida en macrófagos pulmonares in vivo, los EV de choque séptico se marcaron con vibrantes de colorante fluorescente e inculcaron ratones por vía intratrillada. Después de 24 h, las muestras de tejido pulmonar se cosecharon e incrustaron en OCT de tejido-tek (Sakura), seccionado a un espesor de 5 µM, fijado con formaldehído al 4% durante 1 h, deshidratado con 30% de sacarosa durante 24 h, y permeabilizado con 0.3% Triton X-100 durante 30 min. Las secciones se bloquearon luego con una solución de bloqueo que contenía al 0,5% de albúmina de suero bovino al 0,5% y al 5% durante 1 hy se incubó con un anticuerpo anti-F4/80 de conejo (ABCAM) durante la noche. Después de eso, las secciones se incubaron con IgG anti-conejo de cabra conjugada con coralita 488 (Proteintech, Wuhan, China) durante 1 h. Los núcleos celulares se marcaron con 1 µg/ml de DAPI, y las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss.
Análisis de transferencia Western
Las células y los EV se trataron con tampón RIPA (ApplyGen, China) suplementado con cóctel inhibidor de proteinasa durante 30 minutos. El kit de ensayo de proteína BCA se usó para la determinación de la concentración de proteínas de lisados. Una cantidad igual de proteína …
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