Resumen
Antecedentes
La flagelina, un potente adyuvante mucoso administrado a través de la ruta intranasal, ha sido ampliamente reconocida por su capacidad para mejorar las respuestas inmunes contra los diversos patógenos. Sin embargo, los efectos y los mecanismos subyacentes por los cuales la flagelina modula la diferenciación de células T CD4+ permanecen entendidas de manera incompleta.
Métodos
Se produjeron proteínas flagelina recombinantes, incluida la flagelina de longitud completa (SF) y una variante deficiente en unión a TLR5 (SFΔ90-97). Se utilizaron un modelo de transferencia de células T CD4+ derivado de OT-II, un modelo clásico de inmunización intranasal y un sistema de cocultivo T de células dendríticas (DC) -CD4+ T. La proliferación y diferenciación de las células T CD4+ se analizaron mediante análisis de citometría de flujo. La secuenciación de ARN y los experimentos de bloqueo de anticuerpos neutralizantes se realizaron para determinar las citocinas esenciales involucradas en la diferenciación Th17 modulada por flagelina.
Resultados
La flagelina promueve preferentemente la diferenciación de células Th17. Las células epiteliales respiratorias (REC), que actúan como células centinela, son las primeras en encontrar estímulos exógenos durante la inmunización intranasal. La flagelina estimula la secreción de varias citocinas solubles al unirse a TLR5 en la superficie de REC, con GM-CSF facilitando la activación funcional de las DC de las vías respiratorias. Las DC con condición con GM-CSF exhiben una expresión de IL-6 regulada al alza que a su vez impulsa la polarización de las células T CD4+ ingenuas hacia el fenotipo Th17. Además, la IL-6 derivada REC regulada con TLR5 se sinergia con DC moduladas con TLR5 para amplificar las señales de polarización Th17, mejorando así la inducción Th17.
Conclusión
La flagelina indujo preferentemente una respuesta inmune mejorada por Th17 y los REC se destacaron sus roles esenciales durante este proceso a través de vías indirectas y directas. Para la vía indirecta, los REC modulan la función de CC a través de GM-CSF. Además, los REC contribuyen directamente a la diferenciación Th17 secretando IL-6.
Introducción
La mayoría de los patógenos invaden al anfitrión a través de la ruta de la mucosa, lo que hace que la inmunidad de la mucosa sea la primera línea de defensa del anfitrión (1). Las vacunas mucosas pueden establecer una respuesta inmune efectiva tanto en las superficies mucosas como sistémicamente (2). En general, las vacunas de subunidades no replicantes son más seguras que las vacunas vidas atenuadas, pero generalmente requieren adyuvantes para respuestas inmunes específicas de antígeno exitosas.
Como refuerzo inmune, los adyuvantes de la mucosa no solo mejoran la inmunogenicidad de los antígenos y promueven la respuesta inmune del huésped, sino que también mejoran la seguridad de las vacunas y reducen los costos al reducir la dosis de antígeno requerido y el número de administraciones. La flagelina, la proteína estructural primaria de los filamentos flagelar bacteriano, es un patrón molecular (PAMP) asociado a patógenos (PAMP) (PAMP) (PAMP)3). The intranasal adjuvant activity of flagellin has been extensively documented, showing that it can significantly enhance both mucosal and systemic antigen-specific antibody responses, as well as increase the protective efficacy of vaccines against various pathogens including Streptococcus mutans, influenza virus, respiratory syncytial virus, SARS-CoV-2, Streptococcus pneumoniae and Zika virus, etc.
La activación efectiva de las células T CD4+ es crítica para mantener la inmunidad inducida por la vacuna a largo plazo. Las células CD4+ T helper (TH), como componentes clave del sistema inmune, juegan un papel fundamental en la coordinación de respuestas inmunes adaptativas. Estas células son una población altamente heterogénea que se diferencia en varios subconjuntos al recibir señales relevantes de las células presentadoras de antígeno (4). Las células Th1, definidas por el factor de transcripción maestro T-BET y la citocina de linaje IFN-γ, pueden evitar que las células sean atacadas por bacterias y virus intracelulares. Las células Th2, definidas por el factor de transcripción maestra GATA3 y las citocinas características IL-4, IL-5 e IL-13, están involucradas principalmente en la respuesta inmune contra los helmintos. Las células Th17, definidas por el factor de transcripción maestra RORγT y la citocina característica IL-17, son responsables de las respuestas inmunes intracelulares y extracelulares contra los hongos y las bacterias (5,6,7). La vacunación induce efectivamente la proliferación y diferenciación de subconjuntos específicos de células T CD4+, destacando su papel central en la defensa inmune (8). Existe una variación notable en los subconjuntos TH provocados por flagelina bajo distintas rutas experimentales. La inmunización sistémica con flagelina induce una respuesta inmune polarizada por Th2 contra el antígeno o la polarización Th1 coadministrada dirigida al antígeno de fusión (9). Sin embargo, a través de la ruta de inmunización intranasal, la flagelina promovió la diferenciación dominada por Th17 o una respuesta inmune Th1/Th17 mixta (6, 10, 11). Por lo tanto, los efectos de la flagelina, actuaron como un adyuvante intranasal, en la diferenciación de las células T CD4+ justifican una mayor investigación. Además, el mecanismo subyacente de la polarización de TH modulada por flagelina queda por dilucidar.
La mayoría de las investigaciones que investigan las propiedades adyuvantes de la flagelina se centran en las células dendríticas (DC), que sirven como un vínculo crucial entre las respuestas inmunes innatas y adaptativas ((12). La administración sistémica de flagelina promueve el reclutamiento y activación de CD103+ CDC2, mejorando la secreción de IL-2 e IL-4, que posteriormente induce una respuesta inmune de tipo Th2 (13). Además, la flagelina administrada a través de la mucosa gastrointestinal estimula directamente TLR5 en las DC, lo que desencadena la secreción de IFN-γ para iniciar una respuesta inmune de tipo Th1 (14). Por el contrario, las DC respiratorias exhiben una expresión de TLR5 significativamente baja, lo que los hace poco receptivos a la flagelina administrada a través de la ruta nasal (15, 16). Por lo tanto, queda por explorar cómo la flagelina como un adyuvante intranasal modula DCS para inducir ciertas respuestas de TH.
Otro papel fundamental que no se puede ignorar cuando la flagelina ejerce sus efectos únicos como adyuvante intranasal son las células epiteliales respiratorias (REC). Los REC expresan una variedad de receptores de reconocimiento de patrones y modula la respuesta inmune local en el tracto respiratorio a través de la secreción de citocinas o la interacción de células células (17,18,19). A diferencia de las DC intestinales, que expresan abundantemente TLR5, las DC respiratorias exhiben bajos niveles de expresión de TLR5 (16). En nuestros estudios anteriores y de otro, se ha evidente que las DC respiratorias fueron activadas indirectamente por flagelina a través de GM-CSF secretado por REC activados por TLR5 ((15, 16, 20). Si el GM-CSF derivado de RECS también es esencial para que la flagelina module las DC para inducir ciertas respuesta TH no está claro. Además, dado que los REC activados por TLR5 secretan varios otros tipos de citocinas, si los REC participan directamente en la diferenciación TH modulada por flagelina, es necesario determinar.
En este estudio, buscamos dilucidar el efecto y el mecanismo de la modulación de flagelina adyuvante intranasal en la respuesta de las células T CD4+. Se descubrió que la flagelina adyuvante intranasal aumenta preferentemente una respuesta inmune Th17 y los REC juegan roles esenciales durante este proceso a través de vías indirectas y directas. Para la vía indirecta, los REC activados TLR5 modulan el potencial de DCS a través de la secreción de GM-CSF. Por otro lado, los REC juegan un papel directo en la modulación de la respuesta Th17 a través de la producción de IL-6. Además, la IL-6 se identificó como una citocina esencial para la respuesta Th17 dirigida por DCS modulada por flagelina.
Materiales y métodos
Ratones
Se obtuvieron ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas (18–20 g por ratón) del Centro de Investigación Animal de Laboratorio Hunan y se alojaron en condiciones específicas de Pathogen Free (SPF) en el Centro de Animales de Laboratorio de Laboratorio de Ciencia y Tecnología de Wuhan. Los ratones Knockout (TLR5-/-), OT-II y CD45.1 en un fondo C57BL/6, procedente del laboratorio Jackson, también se alojaron en condiciones específicas sin patógenos (SPF) en el Centro Animal de Animales del Laboratorio de Ciencia y Tecnología de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Wuhan. Todos los animales fueron asignados al azar a grupos antes del experimento.
Expresión, purificación e identificación de proteínas recombinantes
Se prepararon cultivos de expresión a gran escala de células de E. coli BL21 (DE3) que contienen construcciones de flagelina recombinantes. Estas construcciones incluyeron Salmonella Flagellin (SF) de longitud completa, sus variantes truncadas SFΔ90–97 (con una deleción en el dominio de unión a TLR5 Qrvrelav), el antígeno C núcleo VIH-1 P24 y la proteína de fusión SF-P24. Estas proteínas recombinantes que contienen una etiqueta de 6 HIS en el extremo C se prepararon y purificaron usando cromatografía de afinidad en una columna Ni-NTA (Qiagen) y se dializaron contra la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ° C. Los lipopolisacáridos contaminantes (LPS) se eliminaron mediante separación de fases líquidas usando Triton X-114, que preserva la integridad física y la actividad biológica de las proteínas y es seguro para los animales experimentales. Las proteínas purificadas se filtraron a través de filtros de jeringa de acrodisc (Pall) y se almacenaron a -80 ° C. La cuantificación de proteínas purificadas se realizó utilizando el ensayo Bradford. El contenido de LPS residual se midió utilizando el ensayo de Limulus (Asociados de Cape Cod) para garantizar que el contenido de LPS en la proteína fuera inferior a 2 EU/mg. La actividad TLR5 de SF y SF-P24 se verificó in vitro como en nuestro estudio anterior. Brevemente, las células Caco-2 epiteliales intestinales humanas se cultivaron y se sembraron en placas de 48 pocillos y se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO2 durante 5 días. Después de un cultivo nocturno en medio sin suero bovino fetal (FBS), las células se estimularon con SF y SF-P24 o la proteína de control SF △ 90-97 y P24 durante 6 ha a las concentraciones indicadas. Los sobrenadantes se recogieron y cuantificaron para IL-8 con el kit ELISA (Biolegend).
Aislamiento de linfocitos de tejido
El aislamiento de linfocitos de tejido se realizó de la siguiente manera: para los ganglios linfáticos cervicales (CLN), los CLN se digirieron en medio RPMI 1640 sin suero que contenía 1 mg/ml de colagenasa D (Sigma) y 50 µg/ml de ADNasa I (Sigma) a 37 ° C durante 30 minutos. Las suspensiones de linfocitos se obtuvieron luego moliendo el tejido a través de un tamiz celular de 70 μm en el …
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