Inhibición farmacológica de Mutt Homolog 1 (MTH1) en la inflamación alérgica de las vías respiratorias como una nueva estrategia de tratamiento

Resumen

Antecedentes

A pesar del progreso en el tratamiento del asma, existe una necesidad insatisfecha de estrategias terapéuticas adicionales, sobre todo para evitar los efectos secundarios de los corticosteroides. La enzima Mutt Homolog 1 (MTH1) hidroliza purinas oxidadas y evita su inserción al ADN. La inhibición de la molécula pequeña de MTH1 ha mostrado efectos terapéuticos prometedores tanto en el cáncer como en las afecciones inflamatorias. En este estudio, se investigó un inhibidor de la molécula pequeña de MTH1 (Th1579) en modelos de inflamación alérgica.

Métodos

In vitro, se investigaron los efectos sobre la proliferación de células T y la apoptosis. Además, se usó un modelo murino, que usa ratones Balb/C hembra, de inflamación alérgica de las vías respiratorias inducida por OVA para investigar los efectos de la inhibición de MTH1 in vivo.

Resultados

La inhibición de MTH1 evitó la proliferación de células T in vitro e inducía la apoptosis inducida en células T CD4+ humanas aisladas. Sin embargo, la viabilidad de los eosinófilos humanos aislados no se vio afectado por la inhibición de MTH1 in vitro. La inhibición farmacológica de MTH1 en un modelo murino de inflamación alérgica de las vías respiratorias redujo la producción de moco, el reclutamiento de células inflamatorias, como las células T y los eosinófilos en el líquido BAL y el tejido pulmonar, reducción de los niveles plasmáticos de IgE total e IGE-especia-especa, IgG e IgG1, así como los niveles reducidos de ILIL-13 en el fluido de Bal-3 en el flén, el plano, el plano.

Conclusión

La inhibición de MTH1 redujo la proliferación y promovió la apoptosis de las células T in vitro. In vivo, Th1579 humedeció la respuesta inmune asociada a tipo 2 en un modelo murino. Estos hallazgos sugieren que MTH1 podría servir como un objetivo novedoso para tratar la inflamación alérgica de las vías respiratorias.

Introducción

El asma es una de las enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias más comunes que afectan a alrededor de 300 millones de personas en todo el mundo (1, 2). Alrededor del 60-80% de los casos de asma de los adultos están asociados con una respuesta inmune de tipo 2 de larga data y excesiva contra los alérgenos en el aire (3, 4). Los macrófagos y las células dendríticas presentan alérgenos a las células heladas ingenuas de CD4+ T que proliferan, aumentan sus niveles de especies de oxígeno reactivas intracelulares (ROS), siendo sesgadas para diferenciar hacia un fenotipo T Helper 2 (Th2). Además, secretan las citocinas prototípicas tipo 2 IL-4, IL-5 e IL-13 (5,6,7). Posteriormente, las células plasmáticas producen IgE específica de alérgenos que, cuando se unen y se reticulan en el receptor en la superficie de los mastocitos y basófilos, desencadena la liberación de mediadores proinflamatorios. Estos promueven la inflamación, la broncoconstricción, el edema, la producción de moco y causan daño tisular en el pulmón. La inflamación en el asma puede conducir a la remodelación irreversible de las vías respiratorias debido a la fibrosis subepitelial, la degradación de la matriz extracelular, un aumento en la masa de las células del músculo liso e hiperplasia de células caliciformes. La presencia de eosinófilos es un sello distintivo de la inflamación tipo 2. IL-5 promueve la diferenciación de eosinófilos en la médula ósea, estimula su reclutamiento y activación en los sitios de inflamación, así como retrasando su apoptosis. Además, los eosinófilos activados liberan mediadores proinflamatorios que amplifican la inflamación y el daño tisular en los pulmones (3, 4).

Los tratamientos actuales del asma se basan principalmente en agonistas del receptor adrenérgico β2, actuando como broncodilatadores e inhalados corticosteroides, reduciendo la inflamación. Además, se pueden agregar antagonistas muscarínicos, antagonistas del receptor de leucotrienos y corticosteroides orales para reducir aún más la inflamación y aliviar los síntomas (2). En los últimos años, el diseño de varias nuevas terapias biológicas dirigidas, incluidos los anticuerpos monoclonales contra mediadores clave de la inflamación tipo 2, como IGE, IL-4, IL-5 e IL-13, se ha inspirado en la mayor comprensión de la red inflamatoria tipo 2 ((3). Sin embargo, todavía existe la necesidad de nuevos enfoques farmacológicos para modular la inflamación desregulada de las vías respiratorias en el asma alérgica, en particular para reducir la necesidad de corticosteroides que tienen efectos secundarios graves (osteoporosis, trastornos metabólicos que incluyen diabetes y trastornos del estado de ánimo).

Estudios recientes han propuesto la inhibición del homólogo de Mutt 1 de hidrolasa humano 1 (MTH1/ NUDT1) como una estrategia de tratamiento potencial en las enfermedades impulsadas por las células T (8, 9). MTH1 es una enzima de 18-22.5 kDa que desinfecta el grupo de trifosfato de desoxinucleótidos celulares (DNTP) catalizando la hidrólisis de trifosfatos de purina oxidados trifosfatos, DNTP, monofosfatos (DNMP). Las células cancerosas, así como las células T proliferadoras activadas, tienen un equilibrio redox alterado y regulan al alza MTH1 para evitar la inserción de DNTP oxidados en su ADN (Fig. 1A), hacer que las células de MTH1 sean más sensibles a la inhibición de MTH1 (10, 11). La inhibición de MTH1 introduce un estrés oxidativo adicional en las células MTHHigh y asegura que las células no puedan evitar el daño del ADN oxidado. Estudios recientes, que utilizan el inhibidor de la molécula pequeña MTH1 Th1579 (también conocido bajo los nombres OXC-101 y Karonudib), han mostrado una supresión selectiva de las células T activadas. Esto dio como resultado una mayor presencia de los focos de histona γH2AX modificados, que reflejan los brotes de ADN y la apoptosis (9, 12, 13). Th1579 tiene un mecanismo dual en el que interrumpe la polimerización de los microtúbulos en las células proliferantes, lo que provoca un paro mitótico y aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Es importante destacar que también inhibe la actividad de la hidrolasa de MTH1, lo que resulta en la inserción de DNTP oxidados en el ADN genómico. En conjunto, esto da como resultado un paro mitótico, la senescencia y finalmente la apoptosis (Fig. 1A) (9, 11). Dado que el aumento de la producción de ROS, seguida de una regulación positiva de MTH1, se observa en las células T proliferantes, que orquestan la inflamación alérgica, MTH1 puede proporcionar un nuevo objetivo terapéutico en el asma alérgica (9, 14). El objetivo de este estudio fue evaluar el potencial de tratamiento del inhibidor de MTH1 Th1579 en la inflamación alérgica de las vías respiratorias para dirigir específicamente las células T activadas utilizando modelos in vitro e in vivo.

Fig. 1

A – G. (A) Descripción general esquemática de la actividad enzimática de MTH1 y el mecanismo de acción propuesto del inhibidor de MTH1 Th1579. (B) Análisis citométrico de flujo representativo de la expresión de CD3 y CD4 en PMBC humanos y células T CD4+ aisladas, pre y después del aislamiento (n = 10). (do) Histogramas representativos de la tinción del marcador de superficie CD25 en las células T CD4+ después de la estimulación de 96 h ± CD3/CD28 (n = 4). (D) La proliferación celular de células T CD4+ humanas activadas (CD3/CD28), en abscensa o presencia de Th1579, se midió mediante dilución intracelular de colorante fluorescente (n = 4). (mi) Gráficos de puntos de citometría de flujo representativo de células T CD4+ CD4+ de anexina V-FITC/Propidium (PI) (PI) (Vehicle), y células tratadas con Th1579 (0.5 µM; n = 4). (F) Resumen de datos de apoptosis de células T CD4+ (n = 4). (GRAMO) Imágenes representativas de las citospinas teñidas con Grünwald-Giemsa (barra de escala = 5 µM) de células T CD4+ humanas después de 96 h después de la estimulación CD3/CD28 en la abscensa o presencia de Th1579. (H) Transferencia virtual; Cuantificación de MTH1 en células T CD4+ humanas con o sin estimulación CD3/CD28 durante 96 h en condiciones reducidas utilizando la transferencia Western Capilar automatizada de Jess. Los niveles de proteína total (TP) en cada muestra se presentan en % como puntos azules. (I) Área máxima total de MTH1 detectada en Jess, a 25 kDa ± 10%, después de la normalización total de la proteína (n = 3). Los resultados se muestran como media ± DE. Las comparaciones estadísticas con árboles o más grupos se realizaron utilizando ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Dunnett que compara la media de cada grupo con el grupo tratado con DMSO al 0,05%. La prueba t no emparejada de dos colas se usó para comparar dos grupos. (**** P <0.0001, *** P <0.001, ** P <0.01,*P <0.05)

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Materiales y métodos

Aprobación ética

El uso de sangre humana de voluntarios aparentemente sanos fue aprobado por la Junta de Revisión Ética local (no. 2015/801) y se realizó de acuerdo con la Declaración Modificada de Helsinki y después de su consentimiento informado. Todos los experimentos del ratón fueron aprobados por el Comité de Ética de Cuidado de Animales Malmö-Lund (permisos éticos no. M3802-19 y no. 18-20687/2023).

Experimentos in vitro: células T CD4+ humanas y eosinófilos

Se proporciona información detallada en suplementaria Materiales y métodos.

Animales

Los ratones BALB/C femeninos se adquirieron de Janvier (Le Genest-Saint-Isle, Francia) y se mantuvieron durante al menos dos semanas antes del inicio de experimentos. Las condiciones de vivienda y el manejo experimental se realizaron de acuerdo con las pautas para la experimentación y el bienestar de los animales en la Universidad de Lund. Los ratones se alojaron en jaulas de plástico con material de ropa de cama absorbente y en un entorno controlado (temperatura, ciclo de luz/oscuridad, alimentos y agua ad libitum). Los ratones tenían nueve semanas al comienzo del experimento.

Experimentos in vivo

Allergic airway inflammation was induced in BALB/c mice by sensitization with 20 µg of ovalbumin (OVA, cat#vac-pova; EndoFit™, InvivoGen, Toulouse, France) administrated by intraperitoneal injection (ip) in 150 µL alum (1:10) on day 0 and 7. On day 14, 16, 18, and 20 the mice were challenged with OVA using intranasal (in) Administración de 50 µg de OVA (50 µl de 1 mg/ml de OVA) disuelto en agua sin endotoxina estéril. PBS se usó como control negativo. Una inyección IP de Th1579 (60 mg/kg, Oxcia, Estocolmo, Suecia) se disolvió en 20% de hidroxipropil-β-ciclodextrinas (HPβCD; CAT#332607; Sigma-Aldrich, Saint Louis, MI) en tampón de acero (ph 4.5), dexametametonos (2 mget/kg; CAT#D4902; Los ratones se asignaron aleatoriamente a cinco grupos: tratados con vehículos y OVA desafiados (VO, N = 5; inicialmente seis ratones pero un ratón tuvo que ser sacrificado durante la sensibilización de los OVA), tratado con Th1579 y OVA desafiado (a, n = 6; n = 5 para muestras de fluido bal 6), tratado …

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