Resumen
Los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) a menudo desarrollan complicaciones asociadas con sarcopenia; Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. A través de una combinación de experimentos in vitro e in vivo, así como el análisis bioinformático, nuestro estudio identificó a Yap/TAZ como un regulador clave del fenotipo envejecido en el músculo esquelético de pacientes con EPOC. En el músculo esquelético afectado por la EPOC inducida por el humo del cigarrillo, observamos reducciones significativas en los niveles de YAP/TAZ, junto con marcadores que indican el envejecimiento del músculo esquelético y la disfunción. En particular, la sobreexpresión de YAP/TAZ mejoró significativamente estas condiciones. Nuestros resultados sugieren un mecanismo novedoso por el cual el mantenimiento de la actividad de YAP/TAZ interactúa con ACTR2 para preservar la integridad de la membrana nuclear y reducir los niveles de ADNc citoplasmático, atenuando así la activación de la picadura y la senescencia celular. Además, encontramos que YAP está involucrado en la regulación transcripcional de la región promotora ACTR2. En general, preservar la actividad de YAP/TAZ puede ayudar a prevenir el envejecimiento del músculo esquelético asociado con la EPOC, lo que representa una nueva estrategia para intervenir en la sarcopenia relacionada con la EPOC.
Número de ensayo clínico
No aplicable.
Introducción
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es un síndrome clínico complejo con efectos sistémicos (1, 2). La sarcopenia, una condición progresiva relacionada con la edad, se caracteriza por una disminución de la masa muscular, la fuerza o la función fisiológica (3). Es una comorbilidad significativa de la EPOC, con pacientes que generalmente experimentan sarcopenia de 15 a 20 años antes que las personas sanas, a una tasa de prevalencia del 15-40% (4). La sarcopenia exacerba el deterioro de la función pulmonar en pacientes con EPOC, lo que lleva a una menor calidad de vida, mayor discapacidad y mortalidad (5, 6). A pesar de su impacto, los mecanismos específicos subyacentes a la sarcopenia relacionada con la EPOC siguen sin estar claros.
Los estudios han demostrado que en la patogénesis de la EPOC, la respuesta inflamatoria sistémica, la hipoxia, la hipercapnia, el estrés oxidativo y nitrosativo, la disfunción mitocondrial, los trastornos metabólicos y las modificaciones epigenéticas son mecanismos independientes pero interrelacionados ((7). Estos factores afectan colectivamente la homeostasis del músculo esquelético, lo que resulta en una disminución de la masa muscular, la fuerza y la función (8, 9). Investigaciones recientes indican que las alteraciones del músculo esquelético relacionado con la EPOC muestran un fenotipo de envejecimiento acelerado.
YAP y TAZ, dos reguladores transcripcionales altamente relacionados (en adelante como YAP/TAZ), sirven como el nexo que orquesta la interacción entre la mecánica celular, el metabolismo y las cascadas de señalización del desarrollo, que permite respuestas celulares y específicas del contexto. Los roles de YAP y TAZ en el desarrollo pulmonar pueden estar asociados con el enfisema, y se ha demostrado que la activación de YAP/TAZ mitigan el inicio y el avance del enfisema en la EPOC ((10). El músculo esquelético es un tejido altamente adaptable y regenerativo (11). La evidencia reciente sugiere que YAP/TAZ juega un papel crucial en el mantenimiento de la función del músculo esquelético y la homeostasis (12,13,14). Los estudios sobre el envejecimiento del músculo esquelético han demostrado aún más la participación de YAP/TAZ para preservar la homeostasis muscular (15) y potencialmente revirtiendo los efectos del envejecimiento muscular (16), sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes se entienden de manera incompleta.
Para proponer nuevas estrategias para intervenir en la sarcopenia relacionada con la EPOC, nuestra investigación tiene como objetivo aclarar el papel significativo de YAP/TAZ en el proceso de envejecimiento acelerado del músculo esquelético relacionado con la EPOC, explorar métodos para regular el envejecimiento del músculo esquelético e identificar objetivos terapéuticos potenciales.
Materiales y métodos
Modelo de ratón inducido por cigarrillos (CS) de EPOC
Se obtuvieron ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. y se alojaron en una instalación de animales sin patógenos específicos ventilados. Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de la Universidad Médica de Nanjing. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con acceso ad libitum a alimentos y agua. El modelo de ratón COPD se indujo utilizando el sistema sistémico de modelado de humo animal (CSM-AA, Techn Technology, China) con cigarrillos de filtro Huangshan de Anhui China Tobacco Industry Co., Ltd., que tenía un contenido de alquitrán de 10 mg y contenido de monóxido de carbono de humo de 11 mg. El monitoreo en tiempo real del nivel de partículas totales (TPM) y la concentración de monóxido de carbono (CO) se realizó utilizando un monitor de aerosol (Casella, Reino Unido). Los ratones en la cámara de fumigación se expusieron al humo del cigarrillo con un TPM de 500 mg/m3 y un nivel de CO de aproximadamente 288 ± 74 ppm, una vez al día durante 2 h cada vez, 6 días a la semana durante 24 semanas consecutivas. Los ratones de control se expusieron al aire filtrado. La evaluación morfométrica pulmonar de las secciones pulmonares se realizó después de 24 semanas de exposición al humo del cigarrillo para confirmar el establecimiento exitoso del modelo EPOC (17,18,19).
Prueba de fuerza de agarre
Se usó un dinamómetro de empuñadura (KW-ZL, Nanjing, China) para evaluar la resistencia de agarre de las extremidades anteriores y las extremidades posteriores de los ratones. Cada mouse agarró una varilla de malla conectada a un sensor de fuerza con sus extremidades y fue tirada hacia atrás por la cola a una velocidad constante hasta que se liberó el agarre. La fuerza máxima (G) fue registrada automáticamente por el sensor. Cada mouse se sometió a tres pruebas con un intervalo de descanso de 2 minutos entre cada prueba, y el promedio de las tres mediciones se tomó como la resistencia al agarre (20). Esta medición se realizó semanalmente.
Formación de cultivo celular C2C12 y miotubos
Los mioblastos C2C12 derivados de la infraestructura de China de los recursos de la línea celular se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS. Al alcanzar la confluencia del 80%, las células fueron inducidas a diferenciarse por incubación en DMEM con suero de caballos al 2% durante 4 días, con cambios medios cada dos días. Los miotubos completamente diferenciados se utilizaron para experimentos posteriores (17).
Preparación de extracto de humo de cigarrillo (CSE)
El humo producido por 4–6 cigarrillos Huangshan (tabaco chino de Anhui Industrial Co., Ltd., cada uno que contenía 10 mg de caramelo, 0,8 mg de nicotina y 11 mg de monóxido de carbono) se disolvió en medio DMEM. El pH se ajustó a aproximadamente 7.4, y la solución se filtró posteriormente usando un filtro aséptico de 0.22 μm para crear una solución de reserva de CSE. La concentración del CSE líquido original se calculó de la siguiente manera: (nicotina 0.8 mg × número de cigarrillos) / volumen total. Para tener en cuenta la pérdida no medida durante el proceso de encendido y estandarizar la concentración, se midió el valor de absorbancia a 320 nm, dirigiendo un valor de 0.74 ± 0.05. La solución diluida resultante se consideró como la solución CSE estandarizada. Para experimentos posteriores, esta solución se diluyó según sea necesario, con la concentración final de CSE determinada usando la fórmula: (volumen de líquido original CSE / volumen total después de la dilución) × 100% (21, 22).
Sobreexpresión de Yap y Taz en miotubos C2C12
El control negativo del vector de sobreexpresión del ratón (OECON) y los vectores de sobreexpresión de TAZ/TAZ (OEYAP y OETAZ) se obtuvieron de la biotecnología de Weizhen (Shandong, China) y se transfectaron a miotubos C2C12 utilizando el reagente de transfección vitro de LIPO3000 (Thermofisher, Walham, MA, EE. UU.). La transfección se llevó a cabo con 4 µg de plásmido después del protocolo del fabricante. La eficiencia de la transfección y la expresión de proteínas se evaluaron después de 48 h. Los plásmidos utilizados en este estudio incluyeron YAP (PAV-CMV-P2A-GFP), TAZ (PAV-CMV-P2A-RFP) y CTRL (PAV-CMV-RFP).
Tinción de beta-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-EN-GAL)
La senescencia celular se evaluó utilizando el kit de tinción SA-β-Gal. Después de estimular las células C2C12 con CSE al 4% durante 96 h, las células se lavaron tres veces con PBS y se fijaron durante 15 minutos usando formaldehído al 4% a temperatura ambiente. Después de esto, se realizó un lavado adicional con PBS y se aplicó 1 ml de solución de tinción SA-β-GAL recién preparada. Esta solución consistió en solución A (10 µl), solución B (10 µl), solución de tinción C (930 µl) y solución X-Gal (50 µl), lo que resulta en una concentración final de 1 mg/ml. Luego, las células se incubaron durante la noche (16 h) en una incubadora libre de CO2 a 37 ℃ y se observaron bajo un microscopio óptico ordinario.
Producción del serotipo 9 (AAV9) del virus adeno-asociado e inyecciones intramusculares de AAV
AAV9-YAP (NM_001171147.1), AAV9-TAZ (NM_001171147.1), y AAV9-Con Vectores que albergan los promotores CMV fueron proporcionados por Weizhen Biotechnology (Shandong, China), con AAV9 diluidos a una concentración de 2 (: ) 1013 Viral General. AAV9 se inyectó en los cuádriceps derecho y los músculos gastrocnemios. Antes de la inyección, el sitio de inyección se preparó eliminando primero el cabello con un cortacésped. Posteriormente, se inyectaron los músculos de los cuádriceps y el gastrocnemio del ratón a 3 puntos usando un microiringe, con 5 µl administrados en cada punto. Finalmente, el área fue desinfectada con yodofor y se dejó secar.
Recolección de tejidos y preparación de muestras
Los pulmones de ratón, los cuádriceps femoris y los músculos gastrocnemios se disecaron y se secaron. Para la detección de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia, los tejidos se incrustaron en reactivo OCT, se almacenaron en un refrigerador de -80 ° C y se seccionaron a 10 μm de espesor. Luego se realizó un examen histológico. Además, para el análisis de inmunotransferencia, las muestras de tejido se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la recolección.
Análisis de histología de los pulmones y músculos esqueléticos
La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se empleó para evaluar la patología bruta del pulmón de ratón y el músculo esquelético, mientras que la tinción de Masson se utilizó para evaluar la fibrosis pulmonar en ratones. El enfisema se evaluó utilizando la intersección lineal media (MLI) para medir el agrandamiento de la cavidad. Además, el área de sección transversal (CSA) de las fibras musculares se determinó de acuerdo con los protocolos establecidos (23, 24).
