Resumen
Objetivo
Este estudio tiene como objetivo investigar si REDD1 (regulado en el desarrollo y las respuestas de daño del ADN 1) media la translocación nuclear a citoplasmática y la liberación de IL-33 en las células epiteliales de las vías respiratorias inducidas por los ácaros del polvo de la casa (HDM).
Métodos
Los niveles de expresión de REDD1 en pacientes con asma bronquial fueron validados utilizando bases de datos públicas, seguido de un análisis inmunohistoquímico de la proteína REDD1 en las células epiteliales de las vías respiratorias de estos pacientes. Luego se estableció un modelo de asma utilizando líneas celulares de 16 HBE inducidas por HDM, con la eliminación del gen REDD1 realizado. La relación entre los niveles variables de expresión de REDD1, NRF2 y factores inflamatorios relacionados se evaluó utilizando Western Blot y QPCR. Para investigar más a fondo el papel del eje REDD1-NRF2-IL-33 en el desarrollo del asma, empleamos activadores e inhibidores de NRF2 para reevaluar el impacto de REDD1 en IL-33.
Resultados
Tanto a los niveles de ARNm como de proteína, encontramos que REDD1 se sobreexpresó significativamente en muestras de pacientes con asma (P <0.05). La exposición in vitro de 24 horas a HDM indujo una notable translocación nuclear a citoplasmática de IL-33 y aumentó sus niveles en el medio de cultivo de las células de 16 hbe. Además, el tratamiento con HDM reguló significativamente la expresión de REDD1 y NRF2. La eliminación de REDD1 suprimió notablemente la liberación de IL-33 inducida por HDM y la expresión de TNF-α, IL-6 e IL-1β, al tiempo que mejora la expresión de NRF2. Además, el tratamiento con la curcumina del agonista NRF2 inhibió la translocación nuclear a citoplasmática inducida por HDM y la secreción extracelular de IL-33, mientras que el efecto opuesto se observó cuando se usó el antagonista NRF2 ML385.
Conclusión
Este estudio revela el papel regulador crucial del eje REDD1-NRF2-IL-33 en el proceso patológico del asma bronquial. REDD1 modula la expresión de IL-33 y otros factores inflamatorios a través de la vía de señalización de NRF2, influyendo así en el inicio y la progresión del asma.
Número de ensayo clínico
No aplicable.
Introducción
El asma bronquial es una enfermedad crónica inflamatoria crónica de las vías respiratorias (1), caracterizado por la hiperreactividad y la inflamación de las vías respiratorias, y manifestada por síntomas recurrentes como sibilancias, opresión en el pecho y dificultad para respirar. El asma alérgica es el tipo más común, estrechamente asociado con alérgenos en el aire como los ácaros del polvo de la casa (HDM) (2). En particular, el asma persistente moderada a severa afecta significativamente la calidad de vida de los pacientes e impone una carga económica sustancial para el sistema de salud pública (3, 4). Además, si el asma no se controla efectivamente a largo plazo, puede conducir a la remodelación de las vías respiratorias, deteriorando aún más la función respiratoria de los pacientes (5). Por lo tanto, el diagnóstico temprano y el tratamiento personalizado son de gran importancia para el manejo efectivo del asma (6, 7).
Con el desarrollo de técnicas biológicas moleculares, se han descubierto múltiples marcadores moleculares asociados con la progresión y la gravedad del asma (8). En los últimos años, las moléculas derivadas de epitelios de las vías respiratorias han atraído una atención creciente debido al papel fundamental de las células epiteliales de las vías respiratorias en la patogénesis del asma y otras enfermedades de las vías respiratorias. Cuando se exponen a estímulos dañinos, incluidos alérgenos, patógenos o contaminantes, las células epiteliales de las vías respiratorias liberan una serie de alarmas (9), como IL-33 y TSLP, que podrían desencadenar cascadas inflamatorias aguas abajo y facilitar el proceso fisiopatológico del asma (4). Entre estas alarmas derivadas de epiteliales, IL-33 ha atraído especial atención debido a sus funciones duales en las respuestas inflamatorias. Por un lado, se ha demostrado que la IL-33 nuclear inhibe la inflamación (10); Por otro lado, la IL-33 extracelular es un potente mediador proinflamatorio (11). Los ensayos clínicos de fase I e II mostraron que el anticuerpo monoclonal itepekimab dirigido a la IL-33 extracelular dio como resultado niveles reducidos de eosinófilos en sangre y una función pulmonar mejorada en pacientes con asma moderada a severa, lo que indica que IL-33 es un objetivo terapéutico prometedor para la ashma ((((((((12, 13). Sin embargo, sus mecanismos aguas arriba son en gran medida desconocidos.
REDD1 (regulado en el desarrollo y las respuestas de daño al ADN 1), también conocido como DDIT4 o RTP801, es un gen de respuesta temprana que regula las respuestas celulares a diversas tensiones, incluida la deficiencia de energía/nutrientes, hipoxia, daño del ADN, estrés retículo endoplásmico e infección viral. Desempeña un papel importante en el control del crecimiento celular, la apoptosis, la autofagia y el desarrollo del cáncer (14). Los datos recientes indican que REDD1 también está involucrado en la regulación de las respuestas inmunes e inflamatorias. En un estado inactivo, se expresa a niveles bajos en tejidos humanos como los pulmones, los bronquios y los riñones (15), pero se sobreexpresa en células inmunes de pacientes con colitis ulcerosa y lupus eritematoso sistémico, así como en los pulmones de pacientes con enfisema (16,17,18). Se demostró que la falta de REDD1 protege a ratones o células contra respuestas inflamatorias en modelos de colitis ulcerosa, dermatitis de contacto alérgico y enfisema (18, 19). Sin embargo, el papel de REDD1 en el asma, especialmente si está involucrado en la liberación de IL-33, sigue sin estar claro.
Este estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos de REDD1 en IL-33 en las células epiteliales de las vías respiratorias expuestas a HDM y explorar los mecanismos moleculares subyacentes.
Materiales y métodos
Análisis de la expresión de REDD1 en tejidos asmáticos
Basado en la base de datos Omnibus (GEO) de expresión génica (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds), recuperamos los datos del perfil de expresión génica relacionados con el asma bronquial y comparamos los niveles de expresión de REDD1 entre las muestras normales, el asma y los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), y exploramos la correlación entre REDD1 y NRF2, entre los factores REDD1 y los factores inflamatorios en las muestras de asma y EPOC. Además, también comparamos la diferencia expresada de REDD1 entre el asma leve y las muestras de asma severa.
Para validar nuestros hallazgos, realizamos el análisis inmunohistoquímico (IHC) en el tejido epitelial de las vías respiratorias obtenidas a través de biopsia broncoscópica de seis pacientes con asma y tres controles. Las muestras de asma se seleccionaron de los sujetos sensibles a los ácaros del polvo de la casa confirmados por prueba de pinchazo de piel o medición de IgE específica de suero, y un buen control de enfermedad en el momento de la recolección de muestras basado en la puntuación de la prueba de control de asma total (ACT) (≥ 20 puntos). Los sujetos fueron excluidos si tenían un historial de fumar más de 10 Packyears. Las muestras de control se seleccionaron de la etapa temprana de los sujetos de cáncer de pulmón periférico a quienes se les requería broncoscopia para confirmar la estadificación. Las muestras de biopsia de tejido epitelial de las vías respiratorias se toman de bronquios segmentarios inferiores en pacientes con asma y del bronquio segmentario lateral sano en sujetos de control. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado antes de someterse a una biopsia, y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Popular de Zhongshan (Número de aprobación: K2020-14) de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
Inmunohistoquímica
Las muestras de biopsia pulmonar transbronquial se fijaron en formalina. Las muestras se deshidrataron en 50%, 70% y 90% de alcohol absoluto, limpiado en xileno. Las secciones se retiraron y se rehidrataron, y la recuperación de antígeno se realizó con citrato de sodio de 10 mm (pH 6.1). Las secciones seriales de 4 µM se inmunotinaron usando un anticuerpo policlonal de conejo contra REDD1 (1: 200) (ProteinTech, China) durante la noche a 4 ℃ y luego se procesaron con los segundos anticuerpos correspondientes/peroxidasa de rábano picante (1: 100) durante 60 minutos a temperatura ambiente. La intensidad del etiquetado fue evaluada de manera ciega por 2 investigadores independientes y se calificó mediante el uso de un sistema de 5 a escala (20) (0, sin señal; 1, débil; 2, moderado; 3, fuerte; 4, muy fuerte).
Cultivo celular y tratamientos
La línea celular epitelial bronquial humana 16HBE (Biorad Laboratories (Shanghai) Co, Ltd, ATCC, Portland, Oregon) se cultivaron en medio RPMI-1640 (GIBCO) que contenía suero de ternera fetal al 10% (GIBCO) a 37 ℃ y 5% CO2. El medio de cultivo se reemplazó cada 48 h, y las células se pasaron en una proporción de 1: 3 cuando alcanzaron el 80-90% de confluencia, luego se volvieron a ser nuevos platos de cultivo. Cuando la densidad de las células de 16 HBE pasadas alcanzó aproximadamente 80-90%, aproximadamente 2.0 × 10^6 células por placas de 6 pocillos, se expusieron al medio sin suero que contenía 10 µg/ml de extracto de HDM (Greer Laboratories, Estados Unidos) y se incubaron durante 24 h ((21).
Transfección celular y tratamiento farmacológico
Los siRNA dirigidos a REDD1 (Si-REDD1-1: 5′-CCAGGUGGGCAAAGAACUA-3 ′, 5′-UAGUUUGCCCCACCUGG-3 ′; Si-REDD1-2: 5′-CCUGAGGAGAGAACACUUGU-3 ′, 5′-ACAAGUUGUUCUUCUCUCAGG-3 ′; SI-REDD1-REDD1-3: 3: 3: 3: Se sintetizaron 5′-CGGAGGAAGACGGCUUA-3 ‘, 5′-UAAGCCGUGUCUUCCUCCG-3’) (Tsingke Bio, Beijing, China). Las células de 16 hbe fueron transfectadas por estos siRNA utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine ™ 3000 (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche. Cuando la confluencia celular alcanzó el 70-80%, se realizó la transfección. La eficiencia se probó 48 h después de la transfección. El activador NRF2 (Curcumin, Hy-N0005) y el inhibidor (ML385, HY-100523) se adquirieron de MCE. La curcumina y el ML385 se diluyeron por separado en DMSO y PBS antes de su uso.
Western Blot (WB)
Los extractos de proteínas totales se obtuvieron mediante las células de 16 HBE cultivadas en el tampón de lisis de extracción de proteínas TOTAL RIPA (Bioworld Technology, Nanjing, China). Los extractos de proteínas se sometieron a electroforesis en gel SDS-poliacrilamida para la separación. Luego, las proteínas separadas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Después del bloqueo, las membranas se probaron con anticuerpos primarios y luego se incubaron con anticuerpos secundarios. Las bandas se visualizaron mediante el método mejorado de quimioluminiscencia (ECL) (Amersham Biosciences) y se analizaron por ImageJ. Los anticuerpos primarios utilizados en el …
(Tagstotranslate) Redd1 (T) Nrf2 (T) IL-33 (T) Células de epitelio de la vía aérea (T) Astma (T) Sistema de neumología/respiratorio
