Resumen
Antecedentes
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar crónica progresiva caracterizada por la inflamación crónica de las vías respiratorias y el enfisema. La polarización de los macrófagos juega un papel importante en la patogénesis de la EPOC al secretar mediadores inflamatorios. La proteína 4 que contiene bromodominio (BRD4), un lector epigenético que se une específicamente a las histonas, juega un papel crucial en las enfermedades inflamatorias al regular la polarización de los macrófagos. Aquí, intentamos examinar la hipótesis de que la modulación de la polarización de los macrófagos alveolares a través de inhibidores de BRD4 podría tener un potencial para el tratamiento con EPOC.
Métodos
Primero analizamos la expresión de BRD4 y su correlación con los parámetros clínicos y los marcadores de polarización de los macrófagos en transcriptomas de esputo de 94 pacientes con EPOC y 36 individuos sanos. In vivo, el inhibidor de Brd4 JQ1 y el degradador ARV-825 se administraron intraperitonealmente en ratones de enfisema para evaluar sus efectos sobre el enfisema pulmonar y la inflamación. In vitro, el ensayo de ARN-seq y Cut & Tag de BRD4 y H3K27AC se aplicaron para dilucidar cómo BRD4 regula la polarización de los macrófagos.
Resultados
Encontramos una mayor expresión de BRD4 en el esputo inducido de pacientes con EPOC y presentamos una fuerte correlación entre la expresión de BRD4 y los parámetros clínicos, así como la polarización de los macrófagos. Posteriormente, el inhibidor de BRD4 JQ1 y el degradador ARV-825 mitigaron significativamente el enfisema y la inflamación de las vías respiratorias junto con una mejor protección de la función pulmonar en ratones. La inhibición de BRD4 también suprimió la polarización de macrófagos alveolares M1 y M2. El ensayo CUT & TAG de BRD4 y H3K27AC, reveló que la inhibición de BRD4 interrumpió a los súper ambientes (SES) de IRF4 (un factor de transcripción crucial para el macrófago M2), y posteriormente afectó la expresión de la metaloproteinasa de matriz 12 (MMP12) que es vital para el desarrollo de enfyema.
Conclusión
Este estudio sugirió que la regulación negativa de BRD4 podría suprimir la inflamación de las vías respiratorias y el enfisema al interrumpir el SES de la polarización de los macrófagos alveolares IRF4 y alveolares, lo que podría ser un objetivo potencial de intervención terapéutica en la EPOC.
Un diagrama del mecanismo por el cual BRD4 medió el súper ambiente de IRF4 en M2 AMS.
La ilustración gráfica mostró que el apegamiento de BRD4 en AM polarizados M2 conduce a la regulación negativa de la expresión de MMP12, lo que resulta en la mejora del enfisema experimental al interrumpir el súper enhancer de IRF4.
Abstracto gráfico
Introducción
La EPOC es una enfermedad pulmonar crónica progresiva y letal caracterizada por la inflamación y el enfisema de las vías respiratorias crónicas (1). Una respuesta inflamatoria aberrante que involucra inmunidad innata y adaptativa es fundamental para el desarrollo de la EPOC. Una variedad de células inmunes, incluidos macrófagos, neutrófilos y linfocitos T, están involucradas en la patogénesis de la EPOC (2). Entre todos, los macrófagos alveolares (AM) se encuentran abundantemente en pacientes con EPOC y juegan roles esenciales en la inflamación y la remodelación de las vías respiratorias de esta enfermedad (3). Los macrófagos son las células inmunes más plásticas presentes en todos los tejidos y pueden polarizarse comúnmente en macrófagos activados clásicamente (también llamados M1) y alternativamente activados (también llamados M2) macrófagos (4). Los macrófagos polarizados M1 son estimulados por ligandos de interferón-γ (IFN-γ) y receptor de tipo Toll (TLR), que se reconocen por su capacidad para provocar la producción de citocinas como IL-6, IL-1β y TNF-α, y juegan un papel esencial en las respuestas inmune de tipo TH1 de TH1. Los macrófagos M2 se generan por la estimulación de la citocina T-Helper 2 (Th2) IL-4 o IL-13, y secretan citocinas antiinflamatorias (p. Ej., IL-10, TGF-β) y quimiocinas (p. Ej.5).
En el contexto de la EPOC, los AM son células del sistema inmune innato y representan un componente vital de la defensa corporal de primera línea contra los patógenos y las partículas inhaladas (6). Por un lado, los AM expuestos al humo de cigarrillo o los microbios pueden polarizarse en el subtipo M1 y secretar las citocinas y quimiocinas proinflamatorias, desempeñando así un papel crucial en el inicio de la respuesta proinflamatoria (7, 8). Por otro lado, las AM se adaptan a los estados M2 para liberar mediadores activos, también de matriz de metaloproteinasas 12 (MMP12) que han sido reconocidas como un factor clave para causar enfisema (9,10,11). Por lo tanto, ambos tipos de macrófagos son vitales para la patogénesis de la EPOC (12). Como tal, se creía ampliamente que la regulación de la polarización de AMS tiene una promesa significativa para avanzar en la terapia con EPOC.
En particular, los estudios de cohortes clínicas ofrecen una herramienta poderosa para descubrir posibles objetivos terapéuticos. En China, se creó previamente una cohorte de transcriptomas de esputo, que consta de 94 pacientes diagnosticados con EPOC y 36 personas que se consideraron saludables (13) y descubrió que el nivel transcripcional de bromodominio que contiene la proteína 4 (BRD4) se asocia significativamente con los parámetros clínicos y la polarización de macrófagos. Por lo tanto, esta observación sugiere que posee el potencial para servir como objetivo terapéutico para la EPOC. Numerosas enfermedades humanas han estado estrechamente relacionadas con la regulación epigenética aberrante (14). BRD4 es el miembro mejor caracterizado de la familia de proteínas de bromodominio y extra terminal (BET) y es un lector epigenético de residuos de lisina acetilada para regular la transcripción de genes y paisaje de cromatina. Por lo general, actúa como un andamio para los factores de transcripción y se localiza en los promotores y potenciadores genéticos (15). Además, BRD4 juega un papel crucial en la organización de los súper enhancers (SES), que son críticos para impulsar la transcripción de alto nivel de genes específicos y se identifican típicamente en función del enriquecimiento fuerte de H3K27AC (16). Debido al papel vital de BRD4 en diversas progresiones de la enfermedad, incluidos carcinomas, enfermedades inflamatorias, fibrosis y enfermedades vasculares, se han desarrollado varios inhibidores de BRD4, como JQ1, para la intervención de la enfermedad (17,18,19,20). En los últimos años, los degradadores de BRD4 como ARV-825 también se desarrollaron en base a la tecnología de quimera (protac) proteolítica y se analizaron para muchos tratamientos de enfermedades (21, 22). Aunque BRD4 juega un papel fundamental en la regulación de la polarización de los macrófagos M1 y M2, se ha informado que son efectivos en el tratamiento de tumores al modular la función del macrófagos asociado a tumores (23,24,25). Sin embargo, se sabe poco si dirigirse a BRD4 afecta la polarización de AMS y la consecuencia terapéutica para la EPOC. Como tal, planteamos la hipótesis de que la modulación de la polarización de los macrófagos a través de inhibidores de BRD4 es un enfoque terapéutico potencial para la EPOC.
Material y métodos
Cohortes y muestras de pacientes
Este estudio utiliza datos transcriptómicos de las vías respiratorias humanas de dos cohortes separadas de individuos con EPOC en diferentes ciudades de China. Específicamente, la cohorte de descubrimiento consistió en 70 pacientes con EPOC estable y 18 controles sanos, de quienes se recolectaron muestras de esputo inducidas en el primer hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Guangzhou en Guangzhou. La cohorte de validación incluyó 24 pacientes con EPOC estable y 18 controles sanos, de los cuales se obtuvieron muestras de esputo inducidas en el Hospital Popular Shenzhen en Shenzhen. Los criterios de inclusión y exclusión se describieron en estudios anteriores (13). El estudio fue aprobado por el comité de ética de dos centros (referencia no. 2017–22 y KY-LL-2020294-01). Los criterios de inclusión para pacientes con EPOC consistieron en tener más de 40 años y tener un diagnóstico confirmado de EPOC basado en la guía de oro. Específicamente, un volumen espiratorio forzado posterior al broncodilatador en 1 s (FEV1)/relación de capacidad vital forzada <0.7. Los criterios de exclusión fueron: (1) un diagnóstico de trastornos respiratorios conocidos que no sean EPOC; (2) exacerbación de la EPOC dentro de las 4 semanas posteriores a la inscripción; (3) Historia de cirugía pulmonar y tuberculosis; (4) diagnóstico de cáncer; (5) transfusión de sangre dentro de las 4 semanas posteriores a la inscripción; (6) diagnóstico de enfermedades autoinmunes; (7) inscripción en un ensayo de drogas cegadas; y (8) uso de antibióticos dentro de las 4 semanas posteriores a la inscripción. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito.
Los datos de CT de cofre en la cohorte de Guangzhou y la cohorte Shenzhen se importaron por separado a las estaciones de trabajo del software VIDA (Versión 2.2, Apollo; Vida Diagnostics, Coralville, IA, EE. UU.) Y Neulungcare-Qa (versión 1.0, Neusoft Medical Systems Co., Ltd. Shenyang, Habitación de China, China) a Automáticamente el análisis de Automáticamente el Extentador de la Extentación de los Esttiventes de Instentación de Instent of Sttyze de Shenyang) a la extensión de Automáticamente el Extentada de los Esttintasté de la Extentación de la Extentación de los Esttivados de la ExtENTA EXTENTAZE DETENTA EXTENTAZA DETENTA AMÁTICA. (LAA950%).
Modelo murino
Para establecer un modelo de enfisema, se obtuvieron ratones masculinos Bagg Albino (BALB/C), de 6 semanas y con un peso de 25 a 30 g, de Gem Phamatech Co., Ltd., ubicado en Guangdong, China. Para mitigar el comportamiento agonista y prevenir la aparición de enfermedades, se implementaron medidas apropiadas para el cuidado de los animales. Específicamente, todos los ratones se acomodaron en una instalación de animales libres de patógenos, donde estaban alojados en jaulas aisladas que proporcionaban una ventilación suficiente. Además, se mantuvo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, y los ratones recibieron acceso sin restricciones a los alimentos y el agua. Es importante tener en cuenta que todos los experimentos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Sujetos Animales del Hospital Popular Shenzhen (AUP-220714-CRC-0599-01).
Establecimiento de un modelo con enfisema
A los ratones BALB/C se administraron instilación intratraqueal de una mezcla que contenía 7 ug LPS purificadas de Escherichia coli O26: B6 (Sigma-Aldrich, St. Gallen, Suiza) y 1.8 U de la elastasa pancreática porcina (compañía de productos Elastin, Owensville, Mo) en 50-μl PBS para un total de un total de elastasa pancreática. Después de cada exposición a LPS/elastasa, los subgrupos de ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con el inhibidor BRD4 JQ1 (50 mg/kg), el degradador BRD4 ARV-825 (10 y 20 mg/kg), o un vehículo de control en los días 14, 17, 21, 24, 28 y 31 ((26).
Histopatología pulmonar
Los pulmones izquierdos de todos los ratones se recolectaron asépticamente y posteriormente se fijaron en paraformaldehído al 4% durante la noche. Al día siguiente, el pulmón …
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