Perfil de metilación del ADN en un modelo de ratón expuesto al humo del cigarrillo de inflamación de las vías respiratorias

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad respiratoria crónica común y heterogénea caracterizada por síntomas respiratorios persistentes y limitación del flujo de aire.¹ El humo del cigarrillo (CS) se ha considerado como un importante factor de riesgo ambiental para la EPOC. La inflamación de las vías respiratorias inducida por CS contribuye significativamente a la patogénesis de la EPOC,¹ pero sus mecanismos moleculares no se entienden completamente.

La metilación del ADN, como modificación epigenética crucial, juega un papel clave en la regulación de la expresión génica específica de tejido y rasgos complejos.² En los últimos años, algunos estudios han documentado que la metilación anormal del ADN puede conducir a la expresión alternativa de genes específicos, especialmente los genes proinflamatorios y antiinflamatorios.³ que está estrechamente asociado con la susceptibilidad a la EPOC, la disminución de la función pulmonar y la exacerbación.^4,5 Además, se reconoce cada vez más que la metilación del ADN podría ser un vínculo importante entre los factores ambientales y genéticos.^6,7 Evidencias emergentes han demostrado que estímulos ambientales como CS, podrían alterar los patrones de metilación de genes,⁸ y la modificación metilada del ADN inducida por CS se informó en varios estudios.^9,10 Sin embargo, los patrones de metilación del ADN en la inflamación de las vías respiratorias inducida por CS no están bien perfilados.

Por lo tanto, establecimos un modelo de ratón expuesto a CS de inflamación de las vías respiratorias para perfilar la metilación del ADN en todo el genoma mediante secuenciación de bisulfito basada en captura de hibridación líquida (LHC-BS) y descubrir los mecanismos subyacentes.

Materiales y métodos

modelo animal

En nuestro artículo anterior, se estableció un modelo de ratón expuesto a CS de inflamación de las vías respiratorias.¹¹ Brevemente, los ratones C57BL/6 de tipo salvaje (WT) (7 a 9 semanas de edad, 20 a 22 g de peso) se dividieron en dos grupos experimentales: grupo WT (control) y grupo CS, n = 10 ratones por grupo. Todos los ratones estaban libres de patógenos específicos y se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad, a una temperatura ambiente de 22 ± 2 ℃, con libre acceso a alimentos y agua. Los ratones del grupo CS fueron expuestos a cigarrillos Marlboro (Marlboro^®Philips Morris, Estados Unidos, con 1,0 mg de nicotina y 11 mg de alquitrán por cigarrillo) con CS principal durante 2 horas dos veces al día, 6 días a la semana durante 4 semanas consecutivas utilizando una máquina automática para fumar cigarrillos Baumgartner-Jaeger CSM2082i (CH Technologies, West -Wood, NJ, EE. UU.), que genera una concentración de humo de 320–340 mg TPM/m³. Los ratones de control se expusieron a aire filtrado según el mismo programa. A continuación, todos los ratones se anestesiaron por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico y se sacrificaron mediante sección de la arteria femoral. Se usó la tinción de hematoxilina-eosina (HE) en tejidos pulmonares de ratón para mostrar la inflamación de las vías respiratorias inducida por CS. El protocolo del estudio cumplió con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados Utilizados para Experimentación y otros Fines Científicos (1986) y fue aprobado por el Panel de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Escuela de Medicina de China Occidental de la Universidad de Sichuan (número de aprobación: 2020394A) .

LHC-BS

Los tejidos pulmonares de los ratones (n = 3 por grupo) se seleccionaron al azar para la extracción de ADN genómico mediante el kit de tejido sanguíneo DNeasy (Qiagen, Alemania) y posteriormente se usaron para la construcción de bibliotecas. En resumen, se sonicó 1 μg de ADN genómico en fragmentos aleatorios con aproximadamente 200–300 pb. Después de la purificación, la biblioteca de ADN se preparó usando SureSelect^XT Mouse methyl-seq Library Prep Kit (Agilent Technologies, EE. UU.). Posteriormente, el ADN se trató con bisulfito usando EZ DNA Methylation-Gold^TM Kit (Zymo Research, Cat.D5006) según las instrucciones del proveedor. Finalmente, las bibliotecas purificadas se cuantificaron mediante el sistema de análisis Bioanalyzer (Agilent) y el ensayo de PCR en tiempo real. Luego, las bibliotecas se secuenciaron en Illumina Novaseq PE150; el proceso detallado se describió anteriormente.¹²

Análisis de datos de metilación de ADN

Los datos de metilación del ADN se analizaron como se describió en detalle anteriormente.¹³ Brevemente, después de eliminar las lecturas de baja calidad, las lecturas limpias de LHC-BC se alinearon con el genoma de referencia mediante el software Bismark v0.19.0 con bowtie2 (versión 2.3.4.2).¹⁴ La tasa de metilación del ADN de la citosina se evaluó dividiendo el número de lecturas metiladas de apoyo por el número total de lecturas que cubren la citosina. Los niveles de metilación se analizaron utilizando el paquete R, methylKit (versión v1.6.1)¹⁵ y eDMR^dieciséis para regiones diferencialmente metiladas (DMR) de interés (p. ej., promotores, islas CpG), que pueden revelar una mayor relevancia biológica. DMR se definió como ajustado PAGS<0,05 y los niveles de metilación diferenciales absolutos (absolute meth.diff >5%). Finalmente, el software ChIPseeker ubicó y anotó los genes diferencialmente metilados (DMG) relacionados en los DMR.

Microarreglo de ADNc

Los datos de la expresión génica por microarrays de cDNA han sido informados en nuestro estudio anterior.¹¹ Brevemente, de acuerdo con los protocolos del fabricante, el ARN total del tejido pulmonar de ratón se extrajo utilizando el kit miRNeasy (Qiagen). Después de la purificación, el ARN total se generó en ADNc, que era una biblioteca marcada con biotina para hibridar en GeneChip Mouse Gene 2.0 STArray (Affymetrix, EE. UU.) que cubre más de 39 000 transcritos. A continuación, se utilizó Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix) para la detección de señales. Los resultados de las micromatrices se evaluaron mediante el software Expression Console (Affymetrix) y el software Transcriptome Analysis Console (Affymetrix). Luego, se estimó la expresión de cada gen mediante el modelo lognormal-normal. Para el estudio adicional, solo se utilizaron genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) al menos 1,2 veces regulados al alza o a la baja.

Análisis de intersección

Para seleccionar los genes candidatos con posible modificación funcional metilada, se cruzaron los DMG inducidos por CS (CS vs WT) ubicados en los promotores y los DEG inducidos por CS. Los genes metilados funcionales finalmente se identificaron de acuerdo con los efectos inversos de la metilación en los promotores de la transcripción génica.

Análisis de enriquecimiento funcional

Para identificar la función biológica de los genes candidatos, especialmente aquellos con modificación metilada funcional, también llamados genes metilados funcionales, realizamos análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), utilizando ClueGO (Versión 2.5.8)¹⁷ que integra términos GO así como vías KEGG y crea una red de términos GO/vía funcionalmente organizada dentro de Cytoscape (Versión 3.9).¹⁷ Se utilizaron los análisis de enriquecimiento GO y KEGG con una puntuación kappa de 0,5, mostrando ontologías con PAGS valores <0,05. Otras configuraciones eran todas predeterminadas.

Red de interacción proteína-proteína (PPI)

Para identificar aún más las interacciones entre los genes candidatos, especialmente los genes metilados funcionales, se realizó un análisis de red PPI utilizando STRING¹⁸ y se muestra usando CytoScape (Versión 3.9).¹⁹ Para calcular el grado de conectividad entre los genes candidatos en la red PPI, el complemento “Cytohubba” de Cytoscape²⁰ se llevó a cabo para puntuar cada gen de nodo, utilizando 10 algoritmos diferentes, y se obtuvieron los 10 genes de nodo superiores por cada algoritmo, respectivamente (Tabla S1).

Análisis estadístico

Los datos del nivel de metilación (%) se presentaron como mediana (rango intercuartílico, IQR). Todos los análisis estadísticos de este estudio se realizaron con paquetes de software R (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria). P<0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Datos de metilación del ADN

Con base en el método LHC-BS, generamos datos de secuencia sin procesar de 15 Gbp en promedio para cada muestra (Tabla S2). Más del 79 % de las lecturas mapeadas cubrieron ~77 % de las regiones de destino, con una profundidad de secuenciación promedio de 57 × por CpG y una tasa de duplicación del 13 %. Para el análisis posterior, se filtraron las lecturas de secuencias duplicadas.

Inflamación de las vías respiratorias inducida por la exposición a CS y modificaciones metiladas funcionales del ADN

La exposición consecutiva de 4 semanas a CS indujo significativamente una inflamación subaguda de las vías respiratorias (Figura 1A) y mientras tanto aumentó el nivel de metilación del ADN (Figura 1B). Luego, los DMG de 2002 se anotaron con 1009 hipometilados, 853 hipermetilados y 140 tanto hipometilados como hipermetilados (Figura 1C). Es bien sabido que la metilación del ADN ocurre casi en islas CpG que se encuentran principalmente en los promotores, lo que está estrechamente relacionado con la regulación de la expresión génica de acuerdo con una regla de contrarregulación.²¹ Posteriormente, entre estos DMG de 2002, 565 DMG (363 hipometilados, 196 hipermetilados, 6 tanto hipometilados como hipermetilados, Figura 1D) contenían metilaciones en los promotores de genes, que se cruzaron con los DEG. Finalmente, se seleccionaron 135 genes metilados candidatos después del análisis de intersección (Figura 1E), y 58 genes de los 135 genes candidatos, con modificación funcional metilada en promotores…