Resumen
Antecedentes
La bronquiectasis es una condición respiratoria crónica caracterizada por una dilatación y daño irreversible de las paredes bronquiales, lo que lleva a una eliminación mucociliar deteriorada e infecciones recurrentes. Su etiología es diversa; Sin embargo, los factores genéticos son críticos en sus formas congénitas y severas. Por lo tanto, nuestro objetivo fue identificar dos nuevas variantes del gen WFDC2, conocido como antiprotease, de pacientes con bronquiectasis y/o fenotipos relacionados que utilizan análisis de secuenciación de genoma completo basado en trío.
Métodos
Los pacientes con bronquiectasis fueron reclutados como trío o quad, y su ADN genómico se aisló. Toda la secuencia del genoma se produjo y analizó para encontrar variantes genéticas causales a través de una tubería interna utilizando el hail Gatk-Dragen. La interpretación de las variantes y la evaluación de la patogenicidad utilizando varias herramientas en silicio se realizaron para identificar variantes causales. Se recolectaron características clínicas de los pacientes con variantes identificadas.
Resultados
En este estudio de descubrimiento que involucra a cuatro pacientes de tres familias, se identificaron dos nuevas variantes en el gen WFDC2 y se sugirieron como variantes patógenas causales para la bronquiectasia. La primera variante (c.291 c> g, p. (Cys97trp)) es una variante homocigota que no se encontró en los datos del genoma de la población. Sin embargo, la segunda variante (c.278g> c, p. (Cys93ser)) se identificó en otro paciente como una variante heterocigota, formando un estado heterocigoto compuesto con la primera variante. En particular, ambas variantes, ubicadas en residuos de cisteína que se conservan en muchas especies, son cruciales para formar enlaces disulfuro esenciales para la estructura y función de las proteínas. Los análisis in-silico clasificaron ambas variantes como patógenas; También se identificaron como probables patógenos según el Colegio Americano de Genética Médica y las Directrices Genómicas. Además, en un estudio de expansión, la variante homocigota también se encontró en dos pacientes no relacionados.
Conclusión
Identificamos dos nuevas variantes bialélicas ubicadas en residuos de cisteína en el gen WFDC2 de pacientes con bronquiectasis que anteriormente no habían recibido un diagnóstico genético. Por lo tanto, considerando investigaciones previas sobre el papel fundamental de la proteína WFDC2 en el sistema respiratorio, estas dos nuevas variantes pueden servir como posibles marcadores de diagnóstico y objetivos terapéuticos para la bronquiectasia.
Número de ensayo clínico
No aplicable
Introducción
La bronquiectasis es una enfermedad respiratoria crónica caracterizada por la dilatación y el daño permanente de las paredes bronquiales, lo que conduce a una eliminación de moco deteriorada e infecciones recurrentes (1,2,3). Esta afección puede deberse a varios factores, que incluyen infección respiratoria, trastorno mucociliar, inflamación, inmune deficiencia y factores idiopáticos. Factores genéticos, particularmente la fibrosis quística y la discinesia ciliar primaria, y las anomalías anatómicas, como las obstrucciones intraluminales y los defectos del cartílago congénito, también son factores contribuyentes ((4, 5). Sin embargo, la mayoría de los casos de bronquiectasis todavía se clasifican como idiopáticos, lo que subraya la necesidad de futuras investigaciones en este campo (6, 7).
La inflamación de las vías respiratorias es un factor crítico en la bronquiectasia (8). Los marcadores inflamatorios están asociados con la gravedad de la enfermedad, los resultados clínicos y los objetivos de tratamiento (9). La inflamación neutrofílica es un sello distintivo de la enfermedad, con mayores niveles de proteasas dañinas como la elastasa de neutrófilos asociada con bronquiectasia más severa (10, 11). Por lo tanto, se proponen nuevos inhibidores para la proteasa de neutrófilos como reguladores de la inflamación neutrofílica en pacientes con bronquiectasia (12). Además, los individuos con bronquiectasia severa demuestran un mayor nivel de mediadores proinflamatorios y niveles reducidos del inhibidor de la proteasa de leucocitos secretores antiinflamatorios (SLPI). Estas observaciones son consistentes con investigaciones recientes que indican que el tratamiento con antibióticos intravenosos da como resultado una disminución de la elastasa de neutrófilos y un aumento de SLPI y otras antiprotasas. Esto respalda un marco conceptual en el que la bronquiectasia severa se correlaciona con un desequilibrio de proteasas y mediadores proinflamatorios, lo que lleva a la supresión de respuestas antiinflamatorias, antiprotease y antimicrobianas epiteliales13, 14).
WFDC2 pertenece a la familia de proteínas núcleos de cuatro disulfuro (WFDC) de proteínas de la proteína de suero (WAP). Esta familia de proteínas se caracteriza por un dominio WFDC conservado que comprende 50 aminoácidos con ocho residuos de cisteína conservados. WFDC2 comprende 124 aminoácidos organizados en dos dominios WFDC (15, 16). WFDC2 se identificó inicialmente como la proteína Epididimis humana-4; Sin embargo, está implicado en la maduración de los espermatozoides. WFDC2 también está regulado en varios cánceres, incluido el carcinoma de ovario, y se ha sugerido como un biomarcador para estos cánceres (17,18,19,20,21). Además, la proteína WFDC2 se expresa en la cavidad oral, el tracto respiratorio, el tracto genital femenino y los túbulos renales distales (22, 23). Estudios anteriores han identificado WFDC2 como una antiprotease de clase cruzada potencial, que puede proporcionar defensa contra la virulencia microbiana con la actividad de la proteasa (24, 25). Además, debido a su semejanza con SLPI y Elafin, que tienen el dominio WFDC, se propone que WFDC2 contribuya a las defensas inmunes innatas dentro del sistema respiratorio (26). Los experimentos con ratones mostraron que la deleción del gen WFDC2 condujo a una falla de la barrera de la mucosa pulmonar y la apoptosis de las células alveolares, lo que resultó en disnea severa e insuficiencia respiratoria, lo que finalmente causó la muerte (((27, 28). Sin embargo, no hay informes sobre el papel del gen WFDC2 en el desarrollo de bronquiectasis. Recientemente, se informó que la deficiencia hereditaria de WFDC2 secretada causa poliposis nasal y bronquiectasis (29).
Por lo tanto, en este estudio, identificamos dos nuevas variantes del gen WFDC2, conocido como antiprotease, de pacientes con bronquiectasis y/o fenotipos relacionados que utilizan análisis de secuenciación de genoma completo basado en trío (WGS). Se sugiere que estas dos variantes son patógenas, desempeñan roles críticos en la estructura de proteínas y funcionan a través de enlaces disulfuro con otras cisteínas. Por lo tanto, las dos nuevas variantes en el gen WFDC2 identificados en este estudio pueden propuestos como variantes de diagnóstico en el desarrollo de bronquiectasis.
Métodos
Diseño de estudio y participantes
Este estudio retrospectivo incluyó seis pacientes con bronquiectasia como el fenotipo principal, que permanecieron genéticamente no diagnosticados. Cuatro pacientes de tres familias fueron reclutados para el estudio de descubrimiento, mientras que dos pacientes de dos familias participaron en el estudio de expansión. Estos pacientes vinieron de Familias Singleton Proband, Duo, Trio y Quad como parte de un estudio piloto de un proyecto nacional llamado ‘Proyecto Nacional de Estudio Piloto de Big Big Data’ ((30). Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. La inscripción de los participantes y el análisis fenotípico se realizaron en cada hospital después de las pautas del proyecto. Información básica, incluida la edad, el sexo y el origen étnico, así como los datos clínicos asociados con los términos de ontología de fenotipo humano (HPO) (https://hpo.jax.org/app/), como síntomas, hallazgos de laboratorio, tomografías calculadas (TC), imágenes de broncoscopia, microscopía electrónica de transmisión (TEM), pruebas de función pulmonar, historial médico e antecedentes familiares. Este estudio fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Instituto Nacional de Salud de Corea (número de aprobación: 2022-02-07-PA, 2022-09-09-10-PA, KDCA-2023-06-06-P-01).
Producción y análisis de datos de WGS
La generación y el análisis de los datos de WGS se han descrito en un informe anterior (31). Brevemente, se generaron datos de WGS en el proyecto nacional del estudio piloto de Bio Big Data (https://www.cirn.re.kr). El ADN genómico se aisló de la sangre completa periférica y se secuenció utilizando la plataforma Illumina Novaseq 6000, seguida de alineación al genoma de referencia humana (versión Grch38). Las llamadas de variantes se realizan utilizando el Kit de herramientas de análisis Genome (GATK, versión 4.2.6.1, Broad Institute, MA, EE. UU.). En particular, todos los procesos se han descrito anteriormente (https://www.kobic.re.kr/kobic/res/ngp).
Descubrimiento variante
La llamada del genotipo conjunto se realizó utilizando la tubería Dragar (Illumina, versión 3.8). Por lo tanto, para estimar la precisión de las llamadas de la variante, se aplicó la recalibración de puntaje de calidad de la variante (VQSR) utilizando GATK (versión 4.2.6.1). El proceso de descubrimiento variante se ha informado previamente (32). Además, para identificar las variantes genéticas involucradas en los fenotipos de la enfermedad, realizamos un análisis WGS basado en Trio para las familias de trío y quadríese utilizando el sistema de granizo (versión 0.2, https://hail.is) (33). Se excluyeron las variantes que se encuentran en sitios múltiples, regiones de baja complejidad, y aquellos que no pasaban el filtro VQSR. Se eliminaron los genotipos con profundidades de llamadas variantes (DP) <10 o> 1000. Las variantes se seleccionaron en función de los criterios de equilibrio alélico (AB): 0.3 ≤ AB ≤ 0.7 para heterocigotos de variantes de nucleótidos individuales (SNV), 0.2 ≤ AB ≤ 0.8 para heterocigotos indel y AB ≥ 0.95 para homocigotos. Se excluyeron las variantes si sus tasas de llamadas estaban por debajo de 0.1 o si el valor p de la prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg fue <10-12. Además, se eliminó cualquier llamada en el cromosoma Y en las muestras femeninas y las llamadas heterocigotas en las regiones no pseudoautosomales en las muestras masculinas. El oleoducto Dragar-Hail identificó de novo, compuesto heterocigoto y snv/indels homocigoto. El predictor de efecto variante se usó para la anotación de genes y de consecuencia de las variantes (34). Además, para garantizar la alta calidad de la variante de novo, las variantes con GQ ≤ 25 en el problema y las que se observaron en más del 0.1% del subconjunto de gnomad no neuro (Grch38 v3.1.2) se filtraron. Las variantes también se excluyeron si el proband AB era <0.3, AB padre fue> 0.1, o la relación DP (profundidad de lectura proband / profundidad de lectura parental) fue <0.3. Para variantes heterocigotas heredadas, solo aquellas ...
(Tagstotranslate) Bronchiectasis (T) WFDC2 (T) Secuenciación de genoma completo
