Resumen
Antecedentes y objetivo
La disfunción endotelial ha sido ampliamente reconocida en las enfermedades crónicas de las vías respiratorias, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el asma; sin embargo, aún no está claro el solapamiento entre asma y EPOC (ACO). La neopterina (NP), un metabolito del trifosfato de guanosina, es un biomarcador novedoso para identificar el mayor riesgo de eventos cardiovasculares adversos. Este estudio tiene como objetivo investigar la asociación de NP con disfunción endotelial y deterioro de la función pulmonar en pacientes con EPOC, asma y ACO.
Métodos
Se reclutó prospectivamente un total de 77 sujetos. Todos los participantes se sometieron a pruebas de función pulmonar, evaluación de la función endotelial, incluida la velocidad de la onda del pulso (PWV) y dilatación mediada por flujo (FMD), y detección de muestras de sangre. Además, se evaluó in vitro el efecto de la NP sobre las células endoteliales (CE) en ambientes anóxicos.
Resultados
La función endotelial disminuyó significativamente en los pacientes con EPOC y ACO en comparación con los controles sanos (PAG< 0,05). El volumen espiratorio forzado en 1 s (FEV1) se correlacionó negativamente con el PWV y positivamente con la fiebre aftosa (PAG< 0,05). La NP aumentó significativamente en pacientes con enfermedades respiratorias crónicas en comparación con el grupo de control, siendo la EPOC la más alta, seguida del asma y la ACO en último lugar (PAG< 0,05). El nivel plasmático de NP mostró correlaciones negativas con el FEV1 y correlaciones positivas con el PWV (PAG <0,05). In vitro, un alto nivel de NP aumentó las especies reactivas de oxígeno (ROS) y disminuyó el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) de las CE de forma dosis-dependiente en un ambiente hipóxico (PAG< 0,05).
Conclusión
La NP se relacionó con la gravedad de las enfermedades crónicas de las vías respiratorias y participó en la patogénesis de la disfunción endotelial. Un nivel alto de NP puede contribuir a la disfunción endotelial al aumentar el estrés oxidativo de las CE de forma dosis dependiente en un ambiente hipóxico. Nuestros hallazgos pueden proporcionar una nueva evaluación y un objetivo terapéutico para la disfunción endotelial relacionada con las enfermedades crónicas de las vías respiratorias.
Introducción
El asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) son dos de las enfermedades crónicas de las vías respiratorias más prevalentes y plantean un importante problema de salud pública.1, 2). Se ha informado que los pacientes con características de asma y EPOC, definida como superposición asma-EPOC (ACO), tienen una progresión más rápida de la enfermedad y una mayor mortalidad.3). La evidencia acumulada indica que el asma, la EPOC y la ACO se correlacionan con un mayor riesgo de eventos cardiovasculares (4,5,6). La formación de inflamación crónica local y sistémica (7), activación de citoquinas y mediadores flogogénicos, y participación del estrés oxidativo (8) puede provocar un deterioro de la función endotelial, que es el vínculo entre las enfermedades crónicas de las vías respiratorias y el riesgo cardiovascular.
Dada la respuesta inflamatoria a la lesión vascular, la disfunción endotelial ha sido ampliamente reconocida en la EPOC.4) y asma (9) pacientes con mayor riesgo cardiovascular y asociados con la gravedad de la enfermedad pulmonar. La inflamación endotelial estimula la producción de citocinas proinflamatorias, como la interleucina (IL)-6, IL-17 e IL-10 en las células endoteliales (CE) (10,11,12). A pesar de los datos disponibles sobre los cambios en los niveles de citocinas y el bioensayo de la función endotelial, incluida la velocidad de la onda del pulso (PWV) y la dilatación mediada por flujo (FMD), en pacientes con EPOC y asma (9, 13), la evidencia de su participación en el desarrollo de la inflamación sistémica y la función endotelial en pacientes con ACO sigue siendo mínima.
La neopterina (NP), un metabolito del trifosfato de guanosina, es producida por macrófagos activados después de su estimulación por interferón γ (14). La NP se ha utilizado ampliamente como un nuevo biomarcador de activación inmune durante la inflamación y el estrés. Estudios previos han informado que los pacientes con enfermedad de las arterias coronarias o hipertensión tienen concentraciones plasmáticas elevadas de NP, lo que se asocia con disfunción endotelial.15). Sin embargo, aún no se ha validado el efecto de la NP sobre la función endotelial y su asociación con la función pulmonar en pacientes con EPOC, asma y ACO.
En consecuencia, en el estudio actual, investigamos las relaciones entre las citocinas inflamatorias, el nivel de biomarcador NP, la función endotelial (PWV y FMD) y la función pulmonar en pacientes con EPOC, asma y ACO, y exploramos los mecanismos subyacentes mediante la detección de especies reactivas de oxígeno endotelial. (ROS) y potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) después de estimular las CE con diferentes concentraciones de NP. Este estudio puede proporcionar conocimientos valiosos para futuros estudios clínicos que se centren en un biomarcador útil para detectar disfunción endotelial y deterioro de la función pulmonar en pacientes con enfermedades crónicas de las vías respiratorias.
Métodos
Asignaturas
Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética y Experimentación Humana de la Universidad Sun Yat-sen (No. (2021)072), y todos los sujetos firmaron un consentimiento informado por escrito. Se incluyeron prospectivamente un total de 77 sujetos de la división de medicina pulmonar y de cuidados críticos del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen. El diagnóstico de asma y EPOC se basó en las directrices de la Iniciativa Global para el Asma y la Iniciativa Global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (1, dieciséis). El diagnóstico de ACO se basó en las siguientes condiciones: (1) pacientes con asma de 40 años o más con restricción persistente del flujo de aire (volumen espiratorio forzado posbroncodilatador en 1 s (FEV1) y relación de capacidad vital forzada (FVC) <0,7) y tenido humo o exposición significativa a biomasa (≥ 10 paquetes-año para humo y ≥ 100 h/año para madera o carbón), y (2) pacientes con EPOC con antecedentes de asma antes de los 40 años o que presenten una prueba de respuesta broncodilatadora positiva . Se reclutó un total de 17 sujetos de control con función pulmonar normal (FEV1 ≥ 80% del previsto y FEV1/FVC ≥ 0,7) entre no fumadores sanos. Los criterios de exclusión de sujetos incluyen los siguientes: (1) pacientes con otras enfermedades pulmonares coexistentes, como enfermedad pulmonar intersticial, embolia pulmonar, bronquiectasias o cáncer de pulmón; (2) pacientes con infección aguda del tracto respiratorio, cirugía o exacerbación aguda dentro de 1 mes; y (3) pacientes con enfermedades cardiovasculares crónicas (ECV), trastornos metabólicos y disfunciones renales o hepáticas.
Prueba de función pulmonar
A todos los sujetos se les realizó una prueba de función pulmonar siguiendo las recomendaciones de la American Thoracic Society y la European Respiratory Society. A todos los sujetos se les realizó una prueba de función pulmonar de forma reproducible y se seleccionaron los mejores valores. Se recogieron los parámetros, que incluían FVC, FEV1, porcentaje de valores previstos de estos parámetros (%FVC y %FEV1), relación FEV1/FVC y ventilación voluntaria máxima (MVV). La prueba de respuesta broncodilatadora se realizó entre 15 y 20 minutos después de la inhalación de 400 µg de salbutamol. Una respuesta positiva se definió como una mejora ≥ 12 % en el %FEV1 y un aumento absoluto de ≥ 200 ml.
Evaluación de la función endotelial.
La fiebre aftosa se evaluó para evaluar la función endotelial mediante el uso de ecografía de alta resolución (UNEX EF 38G, OMRON, Japón) de acuerdo con las directrices actuales (17). En resumen, se midieron el diámetro en reposo y los datos de flujo de la arteria braquial derecha. Luego, se realizó una oclusión suprasistólica del antebrazo (50 mmHg por encima de la presión arterial sistólica) durante 5 minutos, posteriormente se desinfló el manguito y se midió la respuesta de dilatación vascular. La DMF se calculó como el porcentaje máximo de cambio desde el diámetro en reposo hasta el diámetro máximo de la arteria braquial después de desinflar el manguito. Una disminución de la fiebre aftosa indica un aumento del riesgo cardiovascular.
Rigidez arterial
La rigidez arterial se evaluó mediante PWV braquial-tobillo con tonometría de aplanación (BP-203RPE III, OMRON, Japón) siguiendo las pautas actuales (18). Se adjuntó un sensor pletismográfico al manguito que rodeaba el brazo braquial y los tobillos y se utilizó para registrar las formas de onda de la presión del pulso simultáneamente. Se registraron la distancia de la superficie entre los dos sitios de grabación (Δd) y el tiempo de tránsito (Δt). La VOP se calculó como VOP = Δd/ΔT (cm/s). Para el análisis de los datos se utilizó el valor medio de la VOP izquierda y derecha. Un aumento en la VOP indica mayor rigidez arterial y riesgo cardiovascular.
Recogida de muestras de sangre y medición de marcadores inflamatorios.
Se extrajo sangre venosa de todos los sujetos después de ayunar durante la noche durante al menos 8 h. Los marcadores inflamatorios, es decir, IL-10, IL-17, IL-6 y NP en suero, se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas comercial (MEIMIAN, Wuhan, China).
Culturas celulares
Las CE aórticas humanas (HAEC) se cultivaron en medio de crecimiento endotelial (EGM) -2 (Lonza, Verviers, Bélgica) y se expusieron a hipoxia (1% de oxígeno) como se optimizó y caracterizó en estudios previos.
ensayo de ROS
Los niveles de ROS intracelulares se midieron utilizando la sonda de detección de oxidantes diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). Las HAEC cultivadas en placas de cultivo de seis pocillos se expusieron a hipoxia con o sin tratamiento con NP. Después de 24 h, las células se incubaron con 10 µM de DCFH-DA diluido en EGM-2 (sin suero) a 37 ℃ en la oscuridad. Después de 20 minutos de incubación, las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se determinaron mediante citometría de flujo (BD Biosciences, CA, EE. UU.).
Medición de ΔΨm
ΔΨm se midió usando colorante JC-1 (Beyotime) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las HAEC se cultivaron en placas de cultivo de seis pocillos y se expusieron a hipoxia con o sin tratamiento con NP durante 24 h. Posteriormente, las células se tiñeron con solución de tinción JC-1 a 37 ℃ durante 20 minutos y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Leica, Wetzlar, Alemania). Se formaron agregados de JC-1 fluorescentes rojos en las membranas hiperpolarizadas, mientras que los monómeros de JC-1 fluorescentes verdes indicaron despolarización de la membrana. Cuanto mayor sea la proporción de fluorescencia roja y verde, más intacta estará la membrana mitocondrial.
análisis estadístico
SPSS…
