Resumen
Antecedentes
El síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) causa una alta mortalidad y no tiene un tratamiento farmacológico específico. La escasez de drogas contra SDRA se debe en parte a la falta de modelos para SDRA. A medida que los niveles de hemo suero elevados se asocian con una mayor mortalidad en pacientes con SDRA, planteamos la hipótesis de que el hemo circulante contribuye a la patología ARD y puede inducir lesiones pulmonar que se asemejan a la enfermedad humana. Nuestro objetivo fue desarrollar un nuevo modelo para la lesión pulmonar aguda y la investigación de SDRA con lesiones inducidas por hemo en rebanadas pulmonares cortadas por precisión humana (PCLS).
Métodos
Analizamos el hemo y sus enzimas degradantes junto con las citocinas inflamatorias en pacientes con enfermedad de coronavirus 2019 (COVID-19) y ARDS en comparación con sujetos adultos sanos. En las PCL, estudiamos los efectos del hemo sobre la supervivencia celular, la integridad de la membrana, el transcriptoma por expresión génica y el proteoma por análisis de expresión de proteínas o ELISA. También probamos efectos sinérgicos con lipopolisacárido (LPS) en la supervivencia celular, además del hemo para simular la infección bacteriana.
Resultados
Los pacientes con COVID-19 y ARDS habían aumentado los niveles séricos de hemo y hemo oxigenasa 1 (HO-1) en comparación con los controles. En PCLS, la muerte celular inducida por hemo de manera dependiente de la dosis, estimuló señales proinflamatorias y de lesiones y activó cambios en la matriz extracelular (ECM). Los análisis comparativos de las firmas transcriptómicas y proteómicas pulmonares revelaron 27 marcadores comunes (cambio de pliegue log2 mayor que 1, en el valor p ajustado (adj) <0.05 significativo), la mayoría de los cuales fueron inflamatorios. Se criaron citocinas inflamatorias similares en la sangre de pacientes con COVID-19 y ARDS en comparación con los controles. LPS no aumentó la citotoxicidad además del hemo.
Conclusión
La liberación de citocinas inflamatorias inducidas por hemo y la muerte celular en las PCL humanas, que se asemejan a los patrones observados en muestras de sangre de pacientes con COVID-19 y ARDS. Por lo tanto, las PCL estimuladas por hemo representan un nuevo modelo ex vivo para estudios mecanicistas para lesiones pulmonares agudas y SDRA.
Fondo
El síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) es una condición clínica de pacientes que presentan insuficiencia respiratoria hipoxémica aguda debido a la inflamación y la lesión pulmonar aguda (1). Los ARD pueden ser inducidos por causas pulmonares o extra pulmonares (2). La neumonía es la causa pulmonar más común, mientras que la sepsis es la causa extra-pulmonar más común de SDRA (3). La neumonía puede ser causada por patógenos bacterianos que producen endotoxina en caso de bacterias gramnegativas (como LPS) o patógenos virales (4). El SDRA fue inducido por las variantes iniciales del virus del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) y condujo a 7,1 millones de muertes a nivel mundial (5). La superinfección bacteriana se observó comúnmente en pacientes con SDRA relacionados con COVID-19 (6). Incluso fuera del entorno de pandemia, los SDRA contribuyen a una importante carga de atención médica y tiene una mortalidad del 34.9% debido a ARDs leve y 46.1% debido a ARDS severos (7). El manejo de pacientes con SDRA es principalmente de apoyo utilizando oxigenerapia, mientras que no hay una terapia farmacológica efectiva disponible hasta la fecha (8). El mayor desafío en el desarrollo de la terapia farmacológica es la heterogeneidad del SDRA en términos de etiología, patogénesis, manifestación clínica y respuesta al tratamiento (8). Basado en la concentración plasmática de citocinas inflamatorias como la interleucina 6 (IL-6), la interleucina 8 (IL-8), el factor de necrosis tumoral (TNF) y otros (9, 10), se han definido dos fenotipos ARDS: el fenotipo ARDS hipoinflamatorio hipoinflamatorio. El fenotipo hiperinflamatorio se asocia con un mayor riesgo de mortalidad (9, 10). Una mayor mortalidad también se asoció con un aumento de la hemoglobina circulante libre de células (CFH) en pacientes con sepsis severa (11).
En pacientes con enfermedades críticas como SDRA debido a la sepsis, los glóbulos rojos (RBC) a menudo se dañan, liberando la hemoglobina en los espacios intravasculares e intraalveolares (12). Las moléculas de hemoglobina consisten en cuatro cadenas de polipéptidos con hemo incrustado en cada cadena de polipéptidos (13). El hemo está compuesto por un anillo como el compuesto orgánico conocido como porfirina, al que se une un átomo de hierro (13). Hemo tiene propiedades prooxidantes, inflamatorias y citotóxicas (14, 15). Shaver et al. (16) informaron que el nivel de CFH en el espacio aéreo en ARDS se correlacionó con una mayor permeabilidad de la barrera respiratoria y que el daño inducido por CFH está mediado por HEME. Niveles elevados de hemo (17, 18) y sus catabolitos (19, 20) se encontraron en suero o lavado broncoalveolar (BAL) de pacientes con SDRA. La hemo oxigenasa -1 (HO-1) es una proteína de respuesta al estrés, que cataboliza el hemo y se induce después de la exposición al hemo y las citocinas proinflamatorias (21). Los niveles de HO-1 se elevan en el líquido BAL y el tejido pulmonar de los pacientes con SDRA (19). Los niveles de HO-1 pueden ser un marcador pronóstico útil en SDRA y correlacionarse con un mal pronóstico (22, 23). La degradación de la matriz extracelular (ECM) en ARDs tempranos induce la producción de quimiocinas, citocinas, factores de crecimiento y moléculas de adhesión que conducen a una mayor inflamación y lesión (24).
La pandemia Covid-19 aceleró la investigación de SDRA. Sin embargo, a pesar de los arduos esfuerzos, ningún tratamiento farmacológico previene o cura a los pacientes con ARDS COVID-19 (8, 25). Una razón para esta necesidad insatisfecha es la disponibilidad limitada de los modelos preclínicos in vitro o in vivo de ARDS actuales. El papel proinflamatorio del hemo se ha demostrado in vitro (26, 27), y los niveles elevados de CFH en plasma observados en los estudios de ards in vivo subrayan aún más su papel en la patogénesis de la enfermedad (28, 29). Sin embargo, los hallazgos in vitro e in vivo solo pueden traducirse a enfermedades humanas hasta cierto punto. Las rodajas pulmonares (PCL) cortadas con precisión han surgido como una herramienta poderosa para estudiar enfermedades respiratorias quejen los estudios in vitro e in vivo (30, 31). Los PCL han conservado los tipos celulares, la localización original dentro del andamio pulmonar y muestran respuestas funcionales cuando se estimulan (32).
Para abordar la brecha de conocimiento crítico con respecto al papel fisiopatológico del hemo en la lesión pulmonar y el SDRA y proporcionar información sobre las consecuencias del aumento de los niveles de hemo durante el SDRA, sugerimos un nuevo modelo ex vivo de lesiones pulmonares inducidas por hemo en las PCL humanas.
Métodos
Colección de muestras de pulmón humano y generación de PCLS
Generamos PCL a partir del tejido pulmonar humano que se obtuvo de 21 pacientes que se sometieron a cirugía torácica en el Hospital Universitario (Iselspital) en Berna. El tejido pulmonar residual de los procedimientos de diagnóstico se utilizó para la generación de PCLS. En caso de diagnóstico de cáncer, se obtuvo el tejido pulmonar de un margen libre de tumor de un mínimo de 5 cm. Los pacientes consintieron en el uso de tejido residual para la investigación. El muestreo de tejidos fue aprobado por el comité de ética local, Berna, Suiza (KEK-BE_2018-01801, KEK-02418). La edad, el sexo, el diagnóstico primario, el estado de fumar y la prueba realizada con PCL de estos pacientes se describen en la tabla 1.
Tabla 1 Información clínica de donantes de tejido de PCLSMesa de tamaño completoEl tejido pulmonar se procesó inmediatamente o dentro de un máximo de 18 h después de la cirugía. Hasta que se inició el procesamiento, el tejido pulmonar se mantuvo refrigerado a 4 ° C en medio completo que contenía DMEM, glucosa alta, suplemento Glutamax ™, piruvato (Gibco) que contiene HEPES de 20 mm (Sigma Aldrich) y 1% antibióticos/antimicóticos 100 × (Sigma Aldrich) después de las protocolas publicadas previamente (protocolas publicadas previamente (protocolas publicadas previamente (protectores publicados previamente (33). Si se requirió el almacenamiento durante la noche del tejido pulmonar, se agregó su suplemento (i3146, Sigma Aldrich) y suero bovino fetal al 0.1%. El tejido se procesó en condiciones estériles. Se usó dos por ciento de agarosa de punto de fusión bajo (A9414, Sigma Aldrich) para infiltrarse en el tejido pulmonar y se obtuvieron bloques de tejido. Para generar PCLS, los bloques de tejido pulmonar se cortaron a 400 µm de espesor usando el microtomo vibratorio de CompressTome® VF 310-0Z (Precisionary, EE. UU.). Los PCL se cultivaron en medio completo. Antes de procesamiento adicional, los PCL se descansaron en la incubadora a 37 ° C, al 5% de CO2 durante la noche. Las PCL de 4 mm de diámetro se estandarizaron usando golpes de biopsia (Siramo, Suiza) y se cultivaron en placas de 48 pocillos (Falcon) con 250 µl de medio completo por pozo. Para la recuperación del estrés inducido por el procesamiento, los PCL se descansaron en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 durante 24 h antes de comenzar los experimentos.
Preparación hemo
El hemo (10 mm) se preparó disolviendo 65.2 mg de hemina (51280, Sigma Aldrich, Bioxtra ≥ 96% HPLC) en 10 ml de NaOH 0.1 M (Merck). El pH se ajustó al rango de pH 7.4-7.8 con 85% de ácido fosfórico (49685, Sigma Aldrich). La solución hemo se filtró a través de un filtro de 0.22 µm (Millipore) en condiciones estériles en nuestra campana BSL2. El hemo fue alícuota y almacenado a – 20 ° C y se usó para experimentos dentro de una semana.
Estimulación hemo
Antes de la estimulación, los PCL se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (D8537, Sigma Aldrich) para eliminar cualquier RBC residual en PCL. Los PCL se estimularon sin (controles) o con hemo (100 µM en 250 µl de medio completo sin suero bovino fetal) durante 24 h. Después de la incubación, se recogieron sobrenadantes de cada pocillo. Los PCL se lavaron dos veces con DPBS, luego se congelaron y se recogieron en crioviales separados para el aislamiento de ARN y proteína o se usaron para tinción de inmunofluorescencia viable.
Estimulación LPS
Los PCL se estimularon con LPS (TLRL-EBLP, Invivogen) solo (100 ng/ml en 250 µl de medio completo sin suero bovino fetal) o LPS combinado con HEME (LPS 100 ng/ml y HEMA 100 µM en 250 µl de medio completo sin suero bovino fetal) durante 24 h.
Ensayos de viabilidad y citotoxicidad
Determinamos la viabilidad celular después de la estimulación hemo con los ensayos de viabilidad celular Cyquant ™ XTT (Thermo Fisher Scientific). Los PCL (1 PCL/pozo en un 48 platos bien platos con 250 µl de medio sin FBS por pocillo) se estimularon con diferentes concentraciones de hemo (0, 50, 100, 150, 200 µM) durante 24 h. Luego, el reactivo XTT se agregó a las PCL en cultura según las instrucciones del fabricante. Para determinar la citotoxicidad, cyquant ™ ldh citotoxicidad fluorescencia …
(Tagstotranslate) Síndrome de angustia respiratoria aguda (T) Precisión corta cortes pulmonares
