Resumen
Antecedentes
El estrés mecánico y el metabolismo del calcio están asociados con el desarrollo pulmonar y varias enfermedades pulmonares. Nuestra investigación previa demostró que la transducción de señal BDKRB1/Ca2+ puede estar involucrada en la displasia pulmonar resultante de la escoliosis e insuficiencia torácica. Por lo tanto, el presente estudio tiene como objetivo investigar los efectos del estrés mecánico en el crecimiento y la entrada de calcio en las células epiteliales alveolares, así como el papel de la señalización de BDKRB1/Ca2+ en estos procesos.
Métodos
Se emplearon citometría de flujo, CCK-8 y un ensayo de tinción EDU para evaluar el ciclo, la entrada de calcio, la actividad y la proliferación en células RLE-6TN sometidas a tensiones mecánicas de amplitudes variables (5%, 10%y 15%). Se realizaron RT-QPCR y un ensayo de transferencia Western para evaluar los efectos del estrés mecánico en la señalización BDKRB1/Ca2+/CAMKII/MEK1/ERK en las células RLE-6TN.
Resultados
Las amplitudes mecánicas al 10% mejoraron efectivamente la viabilidad, la relación positiva edu, el porcentaje de fase S y la concentración de Ca2+ de las células RLE-6TN, al tiempo que reducen el porcentaje de fase G1. Por el contrario, el 15% de estrés mecánico ejerció un efecto inhibitorio sobre la proliferación de células RLE-6TN. Además, el 10% de estrés mecánico reguló significativamente la expresión de BDKRB1, CAMKIIα/δ, P-MEK1 y P-ERK1/2 en células RLE-6TN. En particular, la eliminación de BDKRB1 atenuó el aumento inducido por el estrés mecánico del 10% tanto en el crecimiento como en la entrada de calcio en las células RLE-6TN. Además, la eliminación de BDKRB1 bloqueó la activación de la vía Ca2⁺/CAMKII/MEK1/ERK inducida por un 10% de estrés mecánico.
Conclusión
Los niveles apropiados de estrés mecánico contribuyen a la entrada de crecimiento y calcio de las células epiteliales alveolares modulando la señalización BDKRB1/Ca2+/Camkii/MEK1/ERK.
Introducción
Los pulmones se someten continuamente a fuerzas mecánicas a lo largo del ciclo respiratorio debido a la expansión repetitiva y la contracción que ocurre durante la inhalación y la exhalación. El estrés mecánico modula el comportamiento y la función celular durante el desarrollo, la lesión y la reparación de los tejidos pulmonares, particularmente en las células endoteliales vasculares y las células epiteliales alveolares, que constituyen las redes vasculares y bronco-alveolares ((1,2,3). La matriz extracelular (ECM) cumple un papel fundamental en la transmisión de fuerzas físicas externas a las células, al tiempo que proporciona apoyo estructural y facilita la función respiratoria. La influencia del estrés mecánico en las interacciones celulares-ECM, especialmente entre las células epiteliales alveolares y las células endoteliales vasculares, es fundamental para el establecimiento y el mantenimiento de la homeostasis mecánica. Sin embargo, la carga mecánica no fisiológica puede contribuir a diversas enfermedades pulmonares, incluida la fibrosis pulmonar, el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), la lesión pulmonar inducida por ventilación y la hipertensión pulmonar ((3,4,5,6). En particular, una variedad de vías de señalización intracelular involucradas en la mecanotransducción regulan la homeostasis fisiológica en estas condiciones asociadas a pulmones, incluidas las integrinas-fak-mapk-nf-κB, rho gtpasa-yap/taz y las vías de hipopótamo (7,8,9). Por lo tanto, dilucidar los mecanismos moleculares impulsados por el estrés mecánico es esencial para mejorar la función pulmonar y promover la remodelación de la red vascular y bronco alveolar.
BDKRB1 se encuentra en el cromosoma 14Q32.1-Q32.2 y codifica una proteína que pertenece a la familia del receptor acoplado a proteínas (GPCR) de la molécula pequeña. Estos receptores se regulan rápidamente después de varios tipos de lesiones y/o inflamación tisulares y están involucrados en respuestas inmunes, dolor neuropático, vasodilatación y reparación de tejidos (10,11,12). Nuestro estudio anterior demostró que la expresión de BDKRB1 se redujo en los tejidos pulmonares de un modelo de escoliosis combinado con hipoplasia pulmonar inducida por displasia torácica (13). En particular, la expresión de BDKRB1 aumentó significativamente después del tratamiento con un sistema amigable para el crecimiento diseñado para mejorar el desarrollo de tejidos pulmonares en lechones. Investigaciones anteriores han demostrado que BDKRB1 está implicado en la patogénesis del cáncer de pulmón y la fibrosis pulmonar idiopática (14, 15) y también sirve como un objetivo terapéutico de Sivelestat en el tratamiento del SDRA (16). Estos hallazgos sugieren que BDKRB1 puede responder al estrés mecánico durante el desarrollo pulmonar. Además, BDKRB1 se reconoce como un regulador del canal de calcio y se ha demostrado que modula el metabolismo del calcio en las células de glioblastoma, los osteoblastos y los macrófagos alveolares ((17,18,19). El metabolismo del calcio mismo juega un papel fundamental en la remodelación inducida por el estrés mecánico de las redes vasculares y bronco-alveolares (20,21,22). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el estrés mecánico puede regular el metabolismo del calcio durante el desarrollo pulmonar a través de la señalización mediada por BDKRB1.
En resumen, este estudio empleó el sistema de tensión FX-5000T para aplicar el estrés mecánico a las células epiteliales alveolares, con el objetivo de investigar su impacto en la expresión de BDKRB1 y dilucidar los roles del estrés mecánico y BDKRB1 en la regulación del metabolismo del calcio. El objetivo es proporcionar nuevos conocimientos sobre la regulación mecanobiológica de la remodelación de la red vascular y bronco alveolar en enfermedades relacionadas con los pulmones.
Materiales y métodos
Cultivo de células epiteliales alveolar
Las células epiteliales alveolares de rata RLE-6TN (Catálogo No. BNCC337708) se obtuvieron de BNCC (China). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 completo (Gibco, EE. UU.), Que comprenden 89% RPMI-1640, 1% de P/S y 10% de FBS. Las células se dividieron en grupos CON, 10% MS, LV-NC y LV-BDKRB1. Después de la tripsinización, las células RLE-6TN (2 × 104 células/pocillo) en los grupos LV-NC y LV-BDKRB1 se sembraron en placas de 12 pocillos. Cuando las células RLE-6TN alcanzaron la confluencia del 40% -50%, el medio se reemplazó con medio completo que contenía 5 µg/ml de polibreno, excluyendo la penicilina-estreptomicina. Las células se transducieron con 5 µl de lentivirus de control o lentivirus dirigido por BDKRB1 (Genomeditech, China) en los grupos LV-NC y LV-BDKRB1, respectivamente. Con aproximadamente 70% de confluencia celular, las células se sometieron a selección de puromicina usando 5 µg/ml de puromicina (MCE, EE. UU.). La eficiencia de eliminación de BDKRB1 en células RLE-6TN se validó usando el ensayo RT-QPCR. Las secuencias de ARN de horquilla corta (shRNA) dirigidas a BDKRB1 fueron las siguientes: TGCTTGAACCCACTGATTTAT (#1), ATTCCTTCTACGCTCTGTTAA (#2) y GCGCTTTAACCATAGCGGAAAT (#3). Los títulos correspondientes de las construcciones lentivirales fueron 5 × 108 Tu/ml (#1), 1 × 108 Tu/ml (#2) y 1 × 108 Tu/ml (#3). Las células RLE-6TN de los grupos CON, 10% MS, LV-NC y LV-BDKRB1 se recogieron posteriormente para el tratamiento de estrés mecánico.
Tratamiento de estrés mecánico
El estrés mecánico se aplicó a las células RLE-6TN utilizando el sistema de tensión FX-5000T (FlexCell International, EE. UU.), Un aparato impulsado por el vacío diseñado para administrar tensión biaxial a las células cultivadas. Brevemente, las células RLE-6TN se sembraron en placas de cultivo FlexCell (placas de 6 pocillos) y se sometieron a tensiones mecánicas con amplitudes variables (5%, 10%y 15%) para diferentes duraciones (6, 12 y 24 h). La frecuencia y la forma de onda del estiramiento mecánico se establecieron en 0.3 Hz y una onda sinusoidal, respectivamente. Las células RLE-6TN de grupos de 10% de MS, LV-NC y LV-BDKRB1 se trataron con estrés mecánico al 10% durante 12 h.
Citometría de flujo
Se empleó un kit de detección de ciclo celular (7SEA Biotech, China) y Fluo-3 AM (Beyotime, China), en combinación con citometría de flujo, para evaluar la distribución del ciclo celular y la entrada de calcio en las células RLE-6TN. Para los ensayos del ciclo celular, RLE-6TN se incubaron con 0,5 ml de solución de tinción con yoduro de propileno (PI) durante 30 minutos. Para el ensayo de entrada de calcio, RLE-6TN se incubaron con fluo-3 am 5 µM durante 45 min. Después del lavado, las células RLE-6TN se incubaron adicionalmente durante 30 minutos adicionales para garantizar la hidrólisis completa de Fluo-3 AM en Fluo-3. La proporción de células PI+ y FluO-3+ se analizó utilizando un citómetro de flujo (Novocyte Advanteon; Agilent, EE. UU.) Para evaluar la distribución del ciclo celular y la entrada de calcio.
Manchas de edu
El kit Beyoclick ™ EDU-594 (Beyotime) se usó para detectar la proliferación de células RLE-6TN. Las células RLE-6TN se cultivaron en placas de 24 pocillos y posteriormente se incubaron durante 2 h con una solución de trabajo de 20 μM 2 × EDU. Las células RLE-6TN marcadas con EDU se fijaron usando paraformaldehído al 4% durante 15 minutos. Las células se lavaron y permeabilizaron secuencialmente con 3% de BSA y 0.3% Triton X-100. Las células se incubaron durante 30 minutos con 0,5 ml de solución de reacción de clics y posteriormente se bloquearon usando un monte antimifade con DAPI. Se usó un microscopio de fluorescencia (BX53; Olympus, Japón) para recopilar imágenes celulares.
Ensayo de transferencia Western
La proteína total se extrajo de las células RLE-6TN usando tampón de lisis RIPA (Sangon, China), y las concentraciones de proteínas se midieron usando un kit de ensayo BCA (Thermo Scientific, EE. UU.). Cantidades iguales de proteína de cada grupo se mezclaron con 5x tampón de carga y se desnaturalizaron en un baño de metal (Thermo Scientific) durante 10 minutos. Las muestras de proteínas desnaturalizadas se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a las membranas de PVDF utilizando una transferencia vertical. Las membranas se bloquearon en polvo de leche escabellada al 5% (Beyotime) durante 1 h y luego se incubaron en bolsas de hibridación con anticuerpos primarios: Rabbit PCAB Anti-BDKRB1 (1: 2000; Biologicals, EE. UU.), Rabbit PCAB anti-THBS1 (1: 2000; Bioss, China), Rabbit PCAB anti- MEK1 (1: 2000; Affinity, Rabbit, USA, USA) MCAB anti-P-MEK1 (1: 5000; ABCAM, EE. UU.), Rabbit PCAB anti-ERK1/2 (1: 5000; Affinity Biosciences), Rabbit MCAB anti-P-Erk1/2 (1: 1000; Invitrogen, EE. UU.), Rabbit PCAB anti-Camkiiα/Δ (1: 2000; Invitrogen), McAb McAb anti-β-Actin (1 000; China), IgG anti-ratón de cabra IgG HRP (1: 4000; Abmart, EE. UU.), Y la IgG anti-conejo de cabra HRP (1: 4000; Abmart). Las señales de proteínas se visualizaron usando un kit ECL (Invitrogen) y se capturaron con un instrumento de quimioluminiscencia 5200multi (Tanon, China).
Extracción de ARN y ensayo RT-QPCR
El ARN total se extrajo de las células RLE-6TN usando el kit Trizol ™ Plus (Invitrogen), y las concentraciones de ARN se determinaron usando una UV …
(Tagstotranslate) Células epiteliales alveolares (T) Estrés mecánico (T) Calcio (T) Crecimiento (T) receptor de bradiquinina B1 (T) Sistema de neumología/respiratorio Sistema respiratorio
