Resumen
Antecedentes
Los microARN (miARN) son reguladores postranscripcionales cruciales involucrados en enfermedades inflamatorias, como el asma. La mala función pulmonar y los problemas de flujo de aire en la infancia están vinculados al desarrollo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) en la edad adulta.
Métodos
Analizamos pequeños datos de ARN-seq de 365 muestras de sangre completa periférica de la genética del asma en el estudio Costa Rica (GACRS) para la asociación con los niveles de flujo de aire medido por FEV1/FVC. Los miRNA (DE) expresados diferencialmente se identificaron usando DESEQ2 en R, ajustando las covariables y aplicando una tasa de descubrimiento falso del 10% (FDR). El análisis incluyó 361 muestras y 649 miRNAs. Los dos de miRNAs se probaron aún más para la asociación con la obstrucción del flujo de aire en un estudio de antiguos fumadores adultos con y sin EPOC.
Resultados
Encontramos 1 miRNA regulado al alza y 1 regulado a la baja en los participantes con flujo de aire por debajo del umbral en comparación con los anteriores. En el estudio de adultos, los mismos miRNAs se regularon y se regularon negativamente en individuos con FEV1/FVC <0.7 versus aquellos con FEV1/FVC> 0.7, que muestran evidencia estadística sugestiva. Los genes objetivo de estos miRNA se enriquecieron para las vías PI3K-AKT, Hippo, Wnt, MAPK y de adhesión focal.
Conclusiones
Dos miRNAs expresados diferencialmente se asociaron con niveles de flujo de aire en niños con asma y obstrucción del flujo de aire en adultos con EPOC. Esto sugiere que los sistemas reguladores genéticos compartidos pueden influir en el flujo de aire infantil y contribuir a la obstrucción del flujo de aire de la edad adulta.
Introducción
El asma afecta a alrededor de 23 millones de personas en los Estados Unidos y más de 300 millones de personas en todo el mundo (1). La característica del asma es una obstrucción del flujo de aire que a menudo es, pero no siempre, reversible. Una obstrucción fija del flujo de aire que no es completamente reversible es una característica de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). El término «obstrucción del flujo de aire» se refiere a la observación de un flujo de aire espiratorio reducido en relación con el volumen total de aire exhalado. Esto se indica por una disminución en la relación de volumen espiratorio forzado en 1 s (FEV1) a la capacidad vital forzada (FVC) (FVC) (2). La hipótesis holandesa (3) propuso una conexión genética (o genómica) entre el asma en la infancia y la EPOC. Los estudios de asociación de genoma a gran escala (GWASS) de asma y EPOC han ilustrado una correlación genética general entre el asma y la EPOC, así como los loci genómicos superpuestos específicos con una dirección de efecto concordante ((4). Sin embargo, a pesar de la fuerte evidencia de susceptibilidad genética parcialmente superpuesta al asma y la EPOC, poca investigación se ha centrado en los impulsores de la limitación u obstrucción del flujo de aire compartido compartido.
Hallazgos recientes han demostrado que la regulación de ARNm por microARN (miRNAs) puede formar parte de la base genómica común del asma y la EPOC (5). Los miARN son moléculas de ARN no codificantes de 21–23 nucleótidos que regulan la expresión génica al unirse a las regiones de ARNm objetivo no traducidas 3 ‘y desencadenar la degradación o inhibición de la traducción ((6). Los miRNA juegan roles reguladores significativos en las respuestas inmunológicas e inflamatorias en varios tejidos y, por lo tanto, son objetivos terapéuticos potenciales en el asma y la EPOC (7). Estudios anteriores de miRNAs en el asma se centraron en el asma en sí, como la expresión circulante de miARN en niños con asma en comparación con los controles sanos, la regulación de la expresión de IL-5 por miRNA, la expresión diferencial de miRNA en asmáticos y controles sanos, y expresión diferencial de miRNA en células epiteliales y de vías respiratorias en asmáticos y controles sanos (((((((((((estándar, la expresión de los controles (sanos (((((estándar8,9,10,11). Anteriormente hemos demostrado la regulación compartida de miRNA del asma y las exacerbaciones de la EPOC (12); Sin embargo, las exacerbaciones generalmente resultan de una interacción compleja de estímulos externos, como alérgenos o infecciones respiratorias, factores sociales o económicos que influyen en la disponibilidad y el costo de la atención hospitalaria exigente, y predisponiendo la biología interna. Este trabajo identificó cinco miR (451b; 7-5p; 532-3p; 296-5p y 766-3p) asociados con exacerbaciones de asma infantil y exacerbaciones de EPOC adultos. Los trastornos multigénicos complejos como el asma han tenido cientos de variantes de ADN asociadas (13), y la regulación genómica es igualmente compleja y multigénica (14). Estudios genéticos previos (15, 16) de la obstrucción del flujo de aire y de las exacerbaciones del asma han identificado loci dispares, lo que lleva a una idea separada de la patogénesis subyacente del asma (17). Los miRNA de sangre periférica no se han investigado en la limitación del flujo de aire u obstrucción en niños con asma y realiza un seguimiento intrigante del trabajo previo que investiga exacerbaciones. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el miARN de sangre periférica, separada de las que regulan las exacerbaciones, regularían las respuestas inmunológicas e inflamatorias asociadas con los niveles de flujo de aire en niños con asma y que estos efectos serían observables en adultos con EPOC. Probamos esta hipótesis en dos cohortes bien caracterizadas, una que incluye niños con asma y otro, incluidos adultos fumadores actuales y anteriores con y sin EPOC.
Métodos
Genética del asma en el estudio Costa Rica
El reclutamiento de sujetos y el protocolo de estudio para la genética del asma en el estudio de Costa Rica (GACR) se han informado previamente (18, 19). En resumen, el GACRS incluyó a 1.165 niños costarricenses asmáticos con asma de 6 a 14 años que fueron reclutados entre febrero de 2001 y julio de 2011. El asma se definió como asma diagnosticada con médicos y con al menos dos síntomas respiratorios (sytezing, coughing o Dyspnea) o una historia de ataques de ashma en el año anterior. Todos los participantes del estudio también tenían una alta probabilidad de tener seis bisabuelos nacidos en el valle central de Costa Rica, según lo definido por un genealogista basado en los apellidos paternos y maternos de cada padre. Después de las pautas de la Sociedad Torácica Americana, la espirometría se realizó utilizando un espirómetro de tach de encuestas (Warren E. Collins, Braintree, Mass). Se obtuvieron el consentimiento informado de los padres y el asentimiento del niño para todos los participantes del estudio. El estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional del Hospital Nacional de Niños (San José, Costa Rica) y Brigham and Women’s Hospital (Boston, MA).
Copdgene
El diseño y el protocolo del estudio para el ensayo COPDGENE (NCT00608764 en clinicTrials.gov) se informaron previamente en detalle (20). En resumen, COPDGene es un estudio prospectivo de fumadores blancos y afroamericanos no hispanos y afroamericanos con al menos 10 años de fumar, con y sin EPOC definida por espirometría. Incluimos a 439 personas de la visita de seguimiento de 5 años de Copdgene con datos de secuenciación de ARN de sangre completa periférica disponible disponible.
Resultado primario
En GACRS, la espirometría se realizó en la visita inicial de acuerdo con las pautas de ATS. Se midió el volumen espiratorio forzado en un segundo (FEV1) y la capacidad vital forzada (FVC). Cada sujeto realizó pruebas de espirometría en la satisfacción tres veces, con el mejor retenido. Estos se convirtieron al porcentaje de FEV1 y FVC predichos utilizando Hankinson et al. (21) Ecuaciones basadas en mexicoamericanos sanos, que evalúan el flujo de aire en relación con la edad, el sexo, la altura y la raza de una persona. Su relación se usó para definir el nivel de flujo de aire. En esta cohorte, se consideró que el umbral para el flujo de aire era una relación FEV1/FVC predicha del 100%. Elegimos este umbral principalmente para aumentar el poder estadístico: la obstrucción del flujo de aire clínico era raro en GACR, por lo que elegir un umbral como FEV1/FVC <70% conduciría a casos desequilibrados frente a controles. Los participantes con un flujo de aire A FV1/FVC predicho del 100% representan el promedio de una persona sana de la edad, el sexo, la altura y la raza apropiados. Esto fue tratado como una variable binaria y nuestro resultado primario.
En el estudio de Copdgene, la espirometría posterior al broncodilatador se recolectó en la visita de seguimiento de 5 años. En esta cohorte, definimos la obstrucción del flujo de aire como FEV1/FVC en bruto <0.7, ya que es la división más relevante en la EPOC, y este umbral se usa como parte del diagnóstico de EPOC.
Se compararon otros datos clínicos y demográficos entre casos y controles utilizando pruebas de chi cuadrado para variables discretas y prueba t de Student para variables continuas.
Datos de secuenciación de miRNA y control de calidad
Utilizamos pequeños datos de secuenciación de ARN previamente secuenciados en sangre completa de 374 muestras GACRS y 450 muestras de copdgene (12). GACRS blood samples were acquired at the time of phenotype assessment, between 2001 and 2005, and were stored at -80 degrees C until sequencing began in 2019. Small RNA-seq libraries were prepared using the NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (PerkinElmer’s, Waltham, MA, USA), which has a maximum input of 10 uL (10 ng to 250 ng). Primero, los adaptadores se ligaron a los extremos 3 ‘y 5’ del ARN. La transcripción inversa se llevó a cabo luego para generar ADNc a partir del ARN ligado. Después de la transcripción inversa, el rendimiento de ADNc se amplificó mediante PCR, utilizando un cebador de PCR con código de barras distinto para cada muestra. Finalmente, el producto de PCR ingresó la selección de tamaño utilizando perlas magnéticas para bibliotecas en el rango de 140-160 pb, lo que resulta en el aislamiento de las bibliotecas de miRNA indexadas. Las bibliotecas se agruparon y secuenciaron en una celda de flujo de alta salida Illumina NextSeq 550, con una longitud de ejecución de lecturas individuales de 75 pb, para generar ~ 10 m de lectura por muestra. Brevemente, aplicamos bloqueadores para miRNAs HSA-MIR-486-5P, HSA-MIR-92A y HSA-MIR-451A (Perkinelmer, Waltham, MA) que se agregaron a la muestra de entrada antes de la creación de la biblioteca (Perkinelmer, Waltham, MA) que se agregaron a la muestra de entrada antes de la creación de la biblioteca (22). Para el control de calidad (QC) de los datos de RNA-seq, el compsra (23) y bcbio pequeño RNA-seq (https://github.com/bcbio/bcbio-nextgen) se implementaron tuberías. Los miRNA con menos de cinco lecturas mapeadas en al menos el 50% de los participantes fueron eliminados antes del análisis. Los datos de miRNA GACRS sin procesar y procesados están disponibles en la expresión génica Omnibus, el acceso GSE244036. Ningún miRNA de paso tenía una muestra más de tres estándar …
(Tagstotranslate) Mirnas (T) Astma (T) Obstrucción del flujo de aire (T) COPD (T) Expresión diferencial (T) Relación FEV1/FVC (T) Sistema de neumología/respiratorio
