Resumen
Antecedentes
El papel de los eosinófilos en la EPOC y su utilidad como biomarcadores para citocinas dirigidas a terapias monoclonales sigue sin estar claro. Investigamos la distribución de eosinófilos en diferentes compartimentos de tejido en la EPOC y analizamos la expresión génica para comprender los posibles impulsores mecanicistas de la inflamación eosinofílica en la EPOC.
Métodos
Se analizó la sangre y el BAL de los voluntarios ex fumar con EPOC leve/moderada (n = 31) y controles de fumar ex sanos (n = 20), y tejido de biopsia bronquial en una subcohort (n = 19 y n = 8, respectivamente). Los genes (DEG) expresados diferencialmente se caracterizaron usando RNaseQ. El análisis proteómico de BAL se realizó utilizando espectrometría de masa.
Resultados
Los sujetos con EPOC tenían más eosinófilos en la sangre y el tejido pulmonar en comparación con los controles, con un aumento de la proteína de eosinófil CLC/galectina-10 en BAL. Sin embargo, los cuentas de eosinófilos de sangre periférica se relacionan mal con los números en el tejido pulmonar (rho = -0.09192, p = 0.3541) o proporciones en BAL (rho = 0.01762, p = 0.4632). La expresión de IL-5Rα de tejido fue mayor en exacerbadores frecuentes y relacionada con eosinófilos tisulares, pero no eosinófilos sanguíneos periféricos.
Los eosinófilos sanguíneos más altos se asociaron con DEG que diferían con el compartimento. Los niveles de eosinófilos tisulares más altos se asociaron con DEG inducidos por IL-13, incluidos PostN en cepillos bronquiales y CCL26 en biopsias bronquiales. El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes en los datos de los cepillados reveló un enriquecimiento significativo de las vías IL-4/IL-13, pero no IL-5, asociadas con la presencia de eosinófilos.
Conclusión
La inflamación pulmonar eosinofílica está relacionada con la frecuencia de exacerbación, pero los eosinófilos pulmonares no se predicen por los recuentos de eosinófilos en la EPOC. Nuestros datos sugieren que las vías mediadas por IL-13 pueden ser responsables de la presencia de eosinófilos de tejido en la EPOC. Se requiere más trabajo para establecer biomarcadores más predictivos de biología de eosinófilos pulmonares para desbloquear este eje para el tratamiento optimizado.
Fondo
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es ahora la tercera causa principal de mortalidad global (1). Los tratamientos actuales permanecen inadecuados, con solo impactos modestos en la morbilidad y la mortalidad. La posibilidad de estratificar a los pacientes para ciertas terapias es atractiva y los informes anteriores destacan los recuentos de eosinófilos en la sangre como un marcador de eficacia de esteroides en la EPOC (revisado (revisado (revisado (revisado (revisado (2, 3)). En particular, Gold recomienda el uso de recuentos de eosinófilos en sangre ≥ 300 células/µl como biomarcador para usarse junto con la evaluación clínica para elegir aquellos que tienen más probabilidades de beneficiarse de corticosteroides inhalados (4). Aquellos pacientes con recuentos de eosinófilos en sangre ≤ 100 células/ µL tienen menos probabilidades de beneficiarse de la terapia con corticosteroides inhalados (4). El potencial de la terapéutica más dirigida, como los anticuerpos dirigidos a IL-5 o su receptor, requiere una mayor comprensión después de los ensayos clínicos que utilizan terapias específicas de eosinófilos mostraron resultados decepcionantes (2). Sin embargo, un ensayo clínico positivo a gran escala de dupilumab (un anticuerpo monoclonal dirigido al componente del receptor compartido IL-4 e IL-13) ha demostrado reducciones en la frecuencia de exacerbación (5). Si bien los recuentos de eosinófilos de sangre periférica parecen útiles para seleccionar pacientes para el tratamiento de dupliumab en general, sigue siendo incierto cuán útil fue este enfoque para determinar la respuesta clínica individual. De hecho, la eficacia de esta intervención fue mayor en los sujetos estratificados aún más por un nivel de feno elevado, lo que sugiere que las medidas directas de inflamación pulmonar pueden ofrecer beneficios adicionales.
Informes anteriores sugieren que los pacientes con EPOC muestran un mayor número de eosinófilos de pulmón en comparación con controles sanos, incluso cuando se excluyen la alergia y el asma (6,7,8,9). Además, el trabajo reciente ha demostrado una asociación entre los eosinófilos sanguíneos elevados y el desarrollo de la enfermedad pulmonar obstructiva (10). La inflamación eosinofílica puede, por lo tanto, jugar un papel importante en la desregulación inmune de la EPOC. Sin embargo, la presencia y proporción de eosinófilos pulmonares varía considerablemente entre los pacientes con EPOC (7, 11, 12). Esto puede reflejar diferencias en la actividad de la enfermedad, ya que también existe una asociación de eosinófilos con exacerbaciones de EPOC (13, 14).
El esputo se ha utilizado para caracterizar la eosinofilia pulmonar en pacientes con EPOC. Sin embargo, la utilidad clínica más amplia de este enfoque es limitada ya que el análisis de esputo se limita en gran medida a los centros de investigación (15). Por lo tanto, los eosinófilos de sangre se usan como marcador sustituto para permitir el fenotipado del paciente de manera más amplia. Mientras que parece haber fuertes correlaciones entre la sangre y los eosinófilos de esputo (13, 14), La asociación de eosinófilos sanguíneos con eosinófilos en tejido pulmonar y lavado broncoalveolar (BAL) no está clara. Además, el impacto de los eosinófilos en estos diferentes compartimentos pulmonares en las medidas de enfermedad no está bien definido (12, 16). Comprender la naturaleza de la inflamación eosinofílica en el pulmón de la EPOC en sí es un primer paso clave para administrar un cambio de paso en los resultados del tratamiento que ya se está logrando en el asma (17).
Para abordar estas preguntas, investigamos la distribución de eosinófilos en las biopsias de sangre, BAL y bronquial de pacientes con EPOC profundamente fenotipados. Además, caracterizamos las diferencias de expresión génica entre la sangre, las biopsias bronquiales y los cepillados epiteliales y sus asociaciones con la presencia de eosinófilos en estos diferentes compartimentos, con el objetivo de comprender el papel y los posibles impulsores del aumento de los eosinófilos en la EPOC.
Métodos
Sujetos
Reclutamos sujetos ex fumadores con EPOC leve o moderada (según el oro) (n = 31) y voluntarios saludables de fumar (HV-ES) (n = 20) como el grupo de control más relevante, todos con ≥ 10 años de historia y habían dejado de fumar ≥ 6 meses antes de la inscripción, como parte del estudio de Micaii (fig. 1). Los pacientes con antecedentes de asma o atopia fueron excluidos de la cohorte. Detalles adicionales sobre esta cohorte se han informado previamente (18,19,20,21,22). Para análisis adicionales, los sujetos con EPOC dependieron de la frecuencia de exacerbación. Los sujetos con EPOC se clasificaron como exacerbadores infrecuentes (es decir) (≤ 1 exacerbación en los 12 meses anteriores antes de la inscripción) o exacerbadores frecuentes (Fe) (≥ 2 exacerbaciones en los 12 meses anteriores antes de la inscripción). Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito, y el estudio fue aprobado por el Servicio de Ética de la Investigación Nacional South Central Estándares éticos – Comités de Hampshire A y Oxford C (LREC No: 15/SC/0528). El muestreo se realizó utilizando broncoscopia fibreóptica y cepillados epiteliales, se recuperaron y procesaron biopsias bronquiales y BAL como se describió anteriormente (19, 21, 22).
Fig. 1Diagrama de flujo de datos del paciente y muestras del estudio de Micaii. El cuadro azul indica datos y muestras utilizadas en este análisis
Imagen de tamaño completoAislamiento y secuenciación de ARN
El ARN total se extrajo del cepillado epitelial y las muestras de biopsia bronquial utilizando el kit universal de ADN/ARN/miRNA (Qiagen) (Qiagen), mientras que el ARN se extrajo de sangre completa usando el kit de ARN sanguíneo PaxGene (Qiagen). La cantidad y calidad de las muestras de ARN se determinaron utilizando el kit de analizador de ARN estándar en un analizador de fragmentos de 96 canales (Agilent Technologies). Muestras extraídas con una concentración de rendimiento> 25 ng/µl de ARN total, y un valor de DV200 (porcentaje de fragmentos de ARN> 200nucleótidos)> = 30% se consideró de cantidad y calidad suficientes para el análisis TotalRNA-Seq. Las muestras se diluyeron a 25 ng/µl utilizando un sistema de automatización de manejo de líquido Tecan Fluent (TECAN). La preparación de la biblioteca se realizó en cuatro carreras separadas, una placa de 96 pozos por carrera. El kit KAPA RNA HyperPrep con riboerasa (HMR) se usó para la transcripción inversa, la generación de ADNc doble cadena y la preparación de la biblioteca posterior e indexación para facilitar la multiplexación (Roche), todo lo cual se realizó a través de la automatización en un tecan fluido. Las bibliotecas se cuantificaron con el analizador de fragmentos de 96 canales utilizando el kit de secuenciación de la próxima generación de sensibilidad estándar (NGS) (Agilent Technologies). Las muestras de cada placa de preparación se agruparon y las piscinas finales (4 en total) se cuantificaron utilizando un instrumento qubit para la determinación de la concentración con el kit de alta sensibilidad de ADN (Thermofisher Scientific). El tamaño del fragmento se determinó utilizando el analizador de fragmentos, el kit NGS de sensibilidad estándar (tecnologías Agilent). Tres de los cuatro grupos de biblioteca se diluyeron aún más a 1 nm y se secuenciaron en un NovaseQ 6000 (Illumina) usando el kit de reactivo NovaseQ 6000 S4, 2 × 76 ciclos. El grupo de biblioteca restante se diluyó a 1.9 nm y se secuenció en Novaseq 6000 (Illumina) usando 2 kits de reactivos NovaseQ 6000 SP S1, 2 × 51 cicladores. Las lecturas promedio por muestra fueron 53.3 millones.
Análisis de RNASEQ
Archivos FASTQ de 307 bibliotecas de secuenciación de extremo emparejado generadas a partir de 120 cepillados epiteliales, 125 biopsias bronquiales y 62 muestras de sangre y se recolectó calidad de lectura para todas las bibliotecas utilizando FASTQC (V0.11.9) (23), Qualimap (v2.2.2d) (24) y las estadísticas de SamTools (v1.15) (25). Las métricas de control de calidad (QC) para Qualimap se basaron en una estrella (v2.7.10a) (26) Alineación contra el genoma humano (Grch38, Gencode V43). A continuación, las métricas de QC se resumieron utilizando MultiQC (V1.12) (27). Dos bibliotecas fueron excluidas; uno debido a una baja tasa de mapeo (57%vs (79%-97%)) y otra debido al bajo rendimiento de secuenciación (210 K lee frente a (20 m-86 m)), dejando 118 cepillados epiteliales, 125 biopsias bronquiales y 62 muestras de sangre para un análisis posterior. Los adaptadores de secuenciación se recortaron luego de las bibliotecas restantes usando NGMerge (V0.3) (28). Se generó un índice de transcriptoma humano que consiste en entradas de ADNc y NCRNA de Gencode (V43) y las lecturas se asignaron al índice usando salmón (V1.7.0) (29). El flujo de trabajo bioinformático se organizó utilizando el sistema de gestión de flujo de trabajo NextFlow (V20.10) (30) y herramienta de gestión de software de bioconda (31).
La expresión génica diferencial se evaluó con DESEQ2 (V …
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