Resumen
Antecedentes
A pesar de la importancia de la vacunación contra la influenza en pacientes con asma, la eficacia de esta vacuna en el asma no se ha dilucidado bien. Nuestro objetivo fue comparar la eficacia de una vacuna contra la influenza de los ratones asmáticos y de control. También evaluamos la eficacia de Addavax ™ como candidato adyuvante, que es equivalente al adyuvante de la vacuna contra la influenza MF59 en los ancianos.
Método
Los extractos de ácaros del polvo de la casa se inyectaron intranasalmente en ratones BALB/C hembra de seis semanas de edad para inducir asma alérgica crónica. Las respuestas de anticuerpos después de la vacunación contra la influenza A/Puerto Rico/Puerto Inactivada por división/8/34 H1N1 con o sin adyuvante Addavax ™ se midieron usando ELISA. La protección viral homóloga se determinó midiendo la tasa de supervivencia, el nivel de inflamación pulmonar y el título del virus pulmonar después del desafío con la tensión del virus de la influenza humana A/Puerto Rico/8/1934 H1N1. Las respuestas de células T específicas de antígeno se determinaron usando citometría de flujo.
Resultado
Los ratones de asma crónicos inmunizados con una vacuna contra la influenza A/Puerto Rico/Puerto Rico/8/34 H1N1 mostraron una pérdida de peso significativa y una mayor carga viral pulmonar después de la infección homóloga de influenza que los ratones vacunados con ingenuos. La producción de IgG, IgG1 e IgG2a específica de antígeno no difirió entre los ratones ingenuos y de asma. Sin embargo, el título de HI en suero fue más bajo en ratones vacunados con el asma después de la infección. La aplicación de Addavax ™ a una vacuna para ratones con asma mejoró la eficacia de la protección antiviral homóloga, pero provocó la infiltración de eosinófilos en los pulmones después de la infección del virus de la influenza homóloga.
Conclusión
La respuesta inmune después de la vacuna A/PR8 inactivada por división difería entre el asma y los ratones ingenuos, particularmente en términos de actividad de anticuerpos y poblaciones de células T. Este estudio mejora nuestra comprensión de cómo el estado de asma puede influir en la efectividad de la vacuna contra la influenza y ofrece información sobre la inflamación eosinofílica inducida por Addavax ™, guiando el desarrollo de estrategias de vacunas contra el virus para individuos sanos y pacientes con asma.
Fondo
El asma es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias que afecta a 300 millones de personas en todo el mundo (1). Han alterado el estado inmune y la remodelación estructural en las vías respiratorias debido a la inflamación crónica inducida por alérgenos (2, 3). El mal funcionamiento de las vías respiratorias y la exacerbación del asma aumentan el riesgo de desarrollar complicaciones graves de la infección por el virus de la influenza. Durante la influenza A 2009 A H1N1pandemic (PH1N1), el asma fue una de las afecciones médicas subyacentes más comunes entre los pacientes hospitalizados por infecciones por PH1N1 en los Estados Unidos y en todo el mundo (4). Sin embargo, a pesar de la importancia de la vacunación contra la influenza en pacientes con asma, ha habido una investigación limitada sobre la efectividad de las vacunas y la función detallada de las células T contra la infección viral en el asma.
El asma alérgica es el tipo de asma más común (5). Exhibe características patológicas de la remodelación de las vías respiratorias, incluido el engrosamiento de las vías respiratorias, el estrechamiento, el edema y el tapón mucoso (6, 7). Se caracteriza inmunológicamente por la producción de inmunoglobulina E (IgE) específica de alérgenos y la inflamación (Th2) dominante de eosinófilos tipo 2 (Th2) ((Th2) (TH2) (8,9,10). En un estudio anterior, demostramos un mayor porcentaje de células T agotadas después de la exposición crónica al alérgenos, con una disminución de la eliminación del virus de la influenza en un modelo de ratón de asma (11). El agotamiento de las células T se refiere a la regresión gradual de la función de las células T y el número debido a la persistencia de la inflamación crónica de bajo grado (12, 13). Estos hallazgos sugieren que el asma puede causar disfunción inmune debido a la inflamación prolongada, lo que puede generar preocupaciones sobre la respuesta reducida a la vacunación.
El virus de la influenza es un virus de ssRNA altamente mutable, con nuevas cepas que emergen cada año. El éxito de la protección anual de la vacuna contra la influenza depende en gran medida de la precisión de la predicción de los virus prevalentes durante la próxima temporada de gripe (14). Por lo tanto, se necesita una vacuna robusta y efectiva que cubra cepas homólogas y heterólogas para aumentar de manera confiable la tasa de éxito de las vacunas contra la influenza, que es aún más importante para las personas con asma.
En este estudio, evaluamos si el estado del asma afecta las respuestas protectoras de la vacuna con protección homóloga y heteróloga, utilizando un modelo de ratón de ratón crónico inducido por ácaros de polvo de la casa (HDM). HDM es un importante alergeno interior en humanos. El modelo de ratón HDM se asemeja mucho a las características del asma alérgica humana, como la hiper-respuesta y la remodelación de las vías respiratorias, el aumento de los niveles de IgE sérico específicos de HDM, la bronquitis eosinofílica y el aumento de los niveles de citocinas inflamatorias, incluida la interleucina (IL) -4 e IL-13. Se utiliza ampliamente en la investigación del asma para investigar los mecanismos subyacentes y explorar las opciones de tratamiento (15,16,17). Además, evaluamos los efectos de Addavax ™, que es equivalente al adyuvante MF59, en la eficacia de la vacuna en ratones asmáticos. MF59 es un adyuvante de vacuna con aceite en agua de escubasa seguro y efectivo utilizado como vacuna contra la influenza para individuos inmunocomprometidos, como los ancianos, los niños y las mujeres embarazadas (18). Nuestro estudio contribuye a la comprensión de la inmunidad de la vacuna en el asma, y ofrece información sobre posibles estrategias de desarrollo.
Método
Inducción y confirmación del modelo de ratones de asma inducido por HDM
Se adquirieron ratones BALB/C de seis semanas de edad de Orient Bio y se mantuvieron en la instalación de animales de la Universidad Nacional de Jeju. En este estudio se utilizó el modelo de ratón BALB/C del asma alérgica crónica inducida por HDM (19). Se resuspendieron 25 µg de extracto de ácaros de polvo de la casa (Dermatophagoides pteronyssinus) (Stallergenes Greer) en 35 µl de PBS y se administraron intranasalmente a ratones 5 días por semana. Los grupos de control o ingenuos se administraron intranasalmente 35 µl de PBS sin extracto HDM. Los ratones fueron desafiados hasta seis semanas. Los ratones de asma fueron sacrificados a las 6 semanas después de la inducción y se evaluaron sus características de asma. El experimento se realizó dos veces con resultados cualitativamente similares. Como indicador de la respuesta alérgica, se midieron los niveles de inmunoglobulina E (IgE) en los sueros y la población de eosinófilos en el fluido de lavado pulmonar y broncoalveeolar (BALF). La población de células inflamatorias en los pulmones y la balf, los niveles de citocinas y quimiocinas inflamatorias, y hematoxilina y eosina (H&E) se analizaron las características histológicas de los tejidos pulmonares para evaluar la inflamación pulmonar. Para investigar las propiedades de las células T en el ratón asmático, la expresión del marcador de agotamiento de células T, la caja HMG asociada a la selección de timocitos (Tox) y el receptor de muerte celular programada (PD-1) se determinaron usando citometría de flujo (20, 21). Los porcentajes de células T productoras de citocinas IFN-γ específicas de HDM e IL-4 se midieron después de la reestimulación con los extractos de HDM.
Vacunas y virus de la influenza dividida
La cepa de virus de la influenza humana A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (A/PR8) se obtuvo de ATCC (VR-95 ™) y se amplificó en huevos de gallina embriones de 9 días. El virus fue cosechado del líquido alantoico. Para producir la vacuna dividida, el líquido alantoico se inactivó con formalina tamponada neutralizada al 1% durante la noche a 4 ° C. El virus se purificó por ultracentrifugación durante 1 ha 30,000 rpm para obtener un virus inactivado. Después de la incubación con Triton X-100 al 1% durante 2 ha 4 ° C para fragmentar el virus, el virus se transfirió a un casete de diálisis y se lavó cinco veces con PBS. La vacuna contra el virus A/PR8 dividida y el virus vivo A/PR8 se mantuvieron a – 80 ° C hasta su uso.
Inmunización de la vacuna y desafío de virus
Los ratones se dividieron en seis grupos (n = 12/grupo): vacuna A/PR8 ingenua, ingenua, adyuvante de A/PR8 (vacío ingenuo), vacuna A/Pr8 ingenua adyuvante adyuvante adyvel Addavax ™). Los grupos de vacunas se vacunaron intramuscularmente dos veces a las 4 y 6 semanas después de la inducción del asma a una dosis de 1 µg de vacuna A/PR8 dividida con o sin Addavax ™. Para la inmunización e infección, los ratones se anestesiaron usando isoflurano. Los sueros se recogieron a los 13 días después de la vacunación principal y 14 días después de la vacunación de impulso para medir los niveles de inmunoglobulina específicos de la vacuna y los títulos inhibidores de la hemaglutinación.
Los ratones fueron sacrificados en tres puntos de tiempo diferentes (n = 4/grupo): (1) 2 semanas después de la vacunación de impulso (2) 5 días después de la infección homóloga (3) 10 días después de la infección homóloga.
A las 2 semanas después de la vacunación de impulso, se midió la función de producción de anticuerpos de memoria de las células plasmáticas (médula ósea) y las células B de memoria (bazo). A las 2 semanas después de la vacuna contra el impulso, los ratones fueron desafiados por vía intranasal con el virus Live A/PR8 (H1N1, a una dosis de 2.5 LD50) para determinar la protección del homo. El LD50 del stock viral A/PR8 se determinó utilizando experimentos preliminares de desafío viral del ratón. 5 días después de la infección viral, los ratones fueron sacrificados para evaluar la patogénesis de la influenza. Los títulos virales se determinaron como la dosis infecciosa del huevo al 50% (EID50)/ml. Después de monitorear el cambio diario del peso corporal y la supervivencia durante 10 días después de la infección, se sacrificaron los ratones y se midieron las poblaciones de células T en células pulmonares y bazo. El experimento se realizó dos veces con resultados cualitativamente similares. Los horarios de inmunización e infección se muestran en la figura 1 complementaria.
Recolección y preparación de muestras
Los sueros se cosecharon mediante centrifugación de sangre recolectada de la vena cava caudal. Las muestras de BALF se recogieron entregando 1,2 ml de PBS a través de la tráquea usando un catéter de calibre 25. Los tejidos pulmonares se obtuvieron por separado para el análisis histológico y celular/citocina. Para el análisis histológico, los tejidos pulmonares se fijaron inmediatamente con formalina al 10%. Los tejidos pulmonares para el análisis celular/químico se mezclaron mecánicamente y se filtraron usando un filtro de células de 100 µM. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se almacenaron a – 80 ° C hasta …
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