Abstracto
Fondo
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad pulmonar crónica que afecta a 3 millones de personas en todo el mundo. La senescencia y las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) se han implicado en la patogénesis de la FPI, aunque aún no está claro cómo las sEV promueven la enfermedad. Aquí, perfilamos los sEV de las células epiteliales bronquiales y determinamos el contenido de ARN pequeño (smRNA).
Métodos
Se recogieron medios acondicionados y se aislaron sEV de células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) y células epiteliales bronquiales humanas enfermas de IPF (DHBE).
Resultados
Se detectó un aumento de la liberación de sEV de los DHBE en comparación con los NHBE (n = 4; p < 0,05) mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas. Los NHBE cocultivados con sEV derivados de DHBE durante 72 h expresaron niveles más altos de proteína SA-β-Gal y γH2AX, ARN p16 y p21 y mayor secreción de proteínas IL6 e IL8 (todas n = 6–8; p <0.05). Los sEV también se cocultivaron con cultivos sanos de la interfaz aire-líquido (ALI) y se observaron resultados similares, con aumentos en la expresión de los genes p21 y p16 y la secreción de IL6 e IL8 (basal y apical) (n = 6; p <0,05). Las mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (TEER), un reflejo de la integridad de la barrera epitelial, se redujeron tras la adición de sEV derivados de DHBE (n = 6; p < 0,05). La secuenciación de ARNm identificó diecinueve miARN expresados significativamente de manera diferencial en sEV derivados de DHBE en comparación con sEV derivados de NHBE, con miARN candidatos validados por qPCR (todos n = 5; p < 0,05). Cuatro de estos miARN se regularon al alza en NHBE cocultivados con sEV derivados de DHBE y tres en cultivos ALI sanos cocultivados con sEV derivados de DHBE (n = 3-4; p < 0,05).
Conclusiones
Estos datos demuestran que los sEV derivados de DHBE transfieren la senescencia a las células sanas vecinas, lo que promueve el estado de enfermedad en la FPI.
Introducción
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad pulmonar fibrótica crónica, progresiva y finalmente mortal que se caracteriza por lesión epitelial, activación de fibroblastos, depósito y remodelación de matriz extracelular (MEC). [1]. A pesar de que afecta a 3 millones de personas en todo el mundo, la causa de la FPI sigue siendo desconocida y las terapias actuales no pueden revertir o incluso detener la progresión de la enfermedad. [1]. Ahora hay una creciente evidencia que indica que la FPI implica una respuesta epitelial aberrante de las vías respiratorias que contribuye a la progresión de la enfermedad. [2]. Artículos recientes han notado cambios en la morfología de los bronquiolos y han destacado funciones prominentes de las células epiteliales bronquiales en la FPI. [3,4,5,6,7,8,9,10]. Los polimorfismos de un solo nucleótido que confieren un mayor riesgo de FPI en varios genes, incluidos MUC5B, DSP, FAM13A y AKAP13, se expresan en las células epiteliales de las vías respiratorias bronquiales. [7,8,9,10,11,12,13]. Aquí, investigamos más a fondo el papel de las células epiteliales bronquiales en la progresión de la enfermedad de FPI.
A pesar de una comprensión incompleta de los mecanismos patológicos subyacentes a la FPI, investigaciones recientes han destacado el papel de la senescencia celular. La senescencia es un proceso mediante el cual las células que experimentan estrés crónico adoptan un fenotipo caracterizado por la detención permanente del ciclo celular, cambios morfológicos y de expresión génica y un fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), que desencadena una respuesta de daño permanente en el ADN. [14, 15]. En modelos de enfermedad fibrótica y FPI, los marcadores de senescencia aumentan en fibroblastos y células epiteliales [14, 16]. Se cree que estas células promueven la enfermedad a través del SASP, que incluye citocinas, proteasas y pequeñas vesículas extracelulares (sEV, también conocidas como exosomas) [16].
Los sEV son vesículas de 100 nm a 250 nm de tamaño, que son un subconjunto de microvesículas liberadas de las células por exocitosis. Son componentes del SASP y pueden transferir su contenido a las células receptoras y afectar el fenotipo de las células vecinas. Se ha informado que los sEV desempeñan funciones en múltiples procesos fisiológicos, incluida la apoptosis, la angiogénesis, la inflamación, la coagulación y la transferencia de carga como proteínas, lípidos y ARN para modular la comunicación celular y las modificaciones epigenéticas. [17]. Los sEV contienen transcripciones de ARNm y miARN, así como pequeñas especies de ARN no codificantes, secuencias repetidas, ARN estructurales, fragmentos de ARNt, ARN de bóveda, ARN Y y ARN pequeños de interferencia. [18]. Hay una incorporación selectiva de pequeñas especies de ARN en los sEV, y se incluyen proteínas y miARN específicos en la carga de sEV según la función y el tipo de la célula. [19, 20]. De particular interés es la presencia de miARN dentro de los sEV. De hecho, se cree que la mayoría de los miARN circulantes están secuestrados dentro de estas vesículas que ofrecen protección contra las ARNasas circulantes. [21, 22]. Por lo tanto, los miARN dentro de los sEV pueden transportarse a las células receptoras y el contenido de miARN puede actuar regulando y ajustando la expresión génica para alterar el fenotipo de la célula objetivo. [23, 24].
Se han observado diferencias en los perfiles de expresión de miARN específicos entre estados sanos y con enfermedad de FPI [25,26,27]. El perfil de expresión de miARN de los sEV derivados tanto del esputo como del suero de pacientes sanos y con FPI reveló varios miARN expresados diferencialmente [25, 26]. De manera similar, existen distintos perfiles de miARN de sEV tanto del líquido de lavado broncoalveolar (BALF) como del tejido pulmonar de pacientes con FPI en comparación con pacientes sanos. [28]. Los sEV también se han investigado funcionalmente, con características profibróticas y senescentes investigadas. [27, 29]. Los sEV derivados de IPF de BALF y los fibroblastos de pulmón humanos primarios pueden mediar la señalización de WNT5A en IPF [29] y los sEV derivados de fibroblastos IPF pueden inducir la senescencia en las células epiteliales [27]. Por el contrario, los posibles usos terapéuticos de los sEV en este contexto también se han investigado con sEV derivados de NHBE que inhiben el factor de crecimiento transformante-beta (TGF-β) inducción de diferenciación de miofibroblastos y senescencia celular epitelial pulmonar [30].
Quedan varias preguntas sin respuesta con respecto al papel de la senescencia en la FPI, incluido el papel del epitelio, el sitio probable de cualquier lesión inicial. Presumimos que el epitelio dañado en IPF puede producir sEV que podrían desencadenar y posteriormente propagar una señal senescente. Nuestro objetivo fue caracterizar y perfilar los sEV de células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) y células epiteliales bronquiales humanas enfermas de IPF (DHBE) y determinar el efecto del contenido de ARN potencialmente regulador en NHBE y cultivos sanos de interfaz aire-líquido (ALI).
Métodos
Cultivo celular y caracterización de muestras.
La aprobación ética del estudio fue otorgada por el Comité de Ética en Investigación (10/HO720/12 y 15/SC/0101). Se obtuvo el consentimiento de todos los pacientes quirúrgicos para la donación de tejidos con fines de investigación biomédica. Los participantes de control no tenían antecedentes de enfermedades respiratorias. Las características de estas celdas se detallan en Archivo adicional 1: Tabla S1. Se aislaron NHBE y DHBE de cepillados bronquiales de controles sanos y pacientes con FPI sometidos a broncoscopia en el Royal Brompton Hospital (Londres, Reino Unido). Para el aislamiento celular, los cepillos bronquiales se agitaron en medios para separar las células y se centrifugaron a 315 ×gramo durante 5 min para sedimentar las células. Las células se cultivaron en medio Lonza BEBM + kit de bala BEGM. Los medios se cambiaron al alcanzar el 80% de confluencia y los medios acondicionados se retiraron para la recolección de sEV después de 72 h. Las células se usaron entre los pases 1 y 3.
aislamiento y caracterización de sEV
Los sEV se aislaron mediante ultracentrifugación (UC) o ExoQuick (Systems BioScience). Para UC, los medios recolectados de NHBE y DHBE se sometieron a centrifugación diferencial a 350 ×gramo durante 10 min para eliminar desechos grandes y células flotantes y 2000 ×gramo durante 10 min, para eliminar células grandes y cuerpos apoptóticos. Los medios se transfirieron a tubos UC y se centrifugaron a 100 000 ×gramo/45.000 RPM a 4 °C durante 1 h (ultracentrífuga Beckman Coulter Optima LE-80 K; rotor Ti45.1 Beckman Coulter de ángulo fijo). Se eliminó el sobrenadante y se repitió el centrifugado en PBS, antes de volver a suspender el sedimento en 100 μl de PBS. Este método…
