Resumen
Antecedentes
Los rinovirus (RV) son la principal causa de resfriados comunes en individuos sanos y están asociados con exacerbaciones agudas en pacientes con enfermedades pulmonares crónicas. Sin embargo, no se dispone de vacunas ni tratamientos eficaces contra el RV. Este estudio investigó el efecto de Euphorbium compositum SN (ECSN6), un medicamento multicomponente y multiobjetivo elaborado a partir de ingredientes naturales, sobre la red de barrera mucosa durante la infección por VD.
Métodos
Se infectaron cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias diferenciadas mucociliares con RV o simulado y se trataron con ECSN6 al 20% o placebo dos veces al día. La integridad de la barrera se evaluó midiendo la resistencia transepitelial (TER), la permeabilidad a la inulina y la expresión y localización de proteínas de uniones intercelulares (IJ). También se midieron la frecuencia del latido ciliar (FSC), la expresión de citocinas proinflamatorias, interferones y mucinas antivirales y la carga viral. Se infectaron ratones C57BL/6 por vía intranasal con RV o simulado y se trataron con ECSN6 al 40 % o placebo dos veces al día. Se determinaron la inflamación de la mucosa sinunasal, la localización de E-cadherina, la carga viral y la expresión del gen mucina.
Resultados
Los cultivos de células no infectadas tratadas con ECSN6 mostraron un aumento pequeño, pero significativo, en TER con respecto al placebo, lo que se asoció con una mejor localización de E-cadherina y ZO-1 en IJ. En cultivos infectados por RV, el tratamiento con ECSN6, pero no con placebo, impidió (1) la reducción de TER inducida por RV, (2) la disociación de E-cadherina y ZO-1 de la IJ, (3) la expresión de mucina y (4) Atenuación del FBC. ECSN6 también disminuyó la expresión de citocinas proinflamatorias estimulada por el RV y la permeabilidad a la inulina. Aunque ECSN6 aumentó significativamente la expresión de algunos interferones antivirales tipo I y tipo III, no alteró la carga viral. In vivo, ECSN6 redujo la inflamación moderada de la mucosa nasal inducida por RV-A1, afectó beneficiosamente las respuestas de citoquinas inducidas por RV-A1 y la expresión de ARNm de Muc5ac y evitó la disociación de E-cadherina de la unión interindivial de la mucosa nasal causada por RV sin efecto sobre la infección viral. autorización.
Conclusiones
ECSN6 previene la disfunción de la barrera mucosa de las vías respiratorias inducida por el VD y mejora la función de la barrera inmunológica y mucociliar. ECSN6 puede mantener la integridad de la función de barrera al promover la localización de proteínas de unión estrecha y de adherencia en la IJ. Esto, a su vez, puede conducir a la disminución observada en las respuestas proinflamatorias inducidas por el VD in vitro. Al mejorar las defensas innatas de la red de barrera mucosa de las vías respiratorias, ECSN6 puede aliviar los síntomas respiratorios causados por las infecciones por VD.
Introducción
La infección por virus respiratorios es la principal causa de los resfriados comunes. Los rinovirus (RV) son la causa más frecuente de resfriados comunes (1). Las infecciones por RV suelen causar síntomas leves de las vías respiratorias superiores, como secreción nasal, dolor de garganta, congestión nasal y, en ocasiones, aumento de la temperatura corporal, que se resuelven en 7 días (2). Sin embargo, el impacto económico de las infecciones por RV es enorme debido tanto a los días de enfermedad como a la compra de medicamentos sin receta para aliviar los síntomas del resfriado. Los gastos anuales asociados con infecciones virales distintas de la influenza se estimaron en 40 mil millones de dólares sólo en Estados Unidos (3) y esto puede ser mucho mayor a nivel mundial. El RV causa exacerbaciones en pacientes con enfermedades pulmonares crónicas subyacentes, como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis quística. Esto aumenta aún más la carga económica a nivel mundial. Hasta la fecha, no se dispone de vacunas ni tratamientos eficaces contra el RV y esto se debe principalmente al gran número de serotipos del RV (4). Otros tratamientos dirigidos a diversos pasos de la replicación viral, las proteasas virales, se han desarrollado sin ningún éxito (5).
RV es un virus de ARN de cadena positiva sin envoltura que pertenece a la familia Picornaviridae. Hay cientos de serotipos y se clasifican en los grupos A, B y C. Los RV que pertenecen a los grupos A y B se unen al ICAM1 humano (virus del grupo principal) o a receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) o receptores similares a LDLR (virus del grupo menor). El rinovirus C es un RV identificado comparativamente recientemente que se une al miembro 3 de la familia relacionado con la cadherina humana (CDHR3) y se asocia con exacerbaciones graves del asma (6).
El epitelio de las vías respiratorias es el objetivo principal de todos los virus respiratorios, incluido el RV. Anteriormente, nosotros y otros hemos demostrado que el RV causa una alteración transitoria de la barrera al aumentar el estrés oxidativo (7,8,9,10). También demostramos que la reducción de la resistencia transepitelial (TER) inducida por RV se acompaña de la disociación de las proteínas de unión estrecha ocludina y claudinas y la proteína de andamiaje, ZO-1, de las uniones intercelulares.7,8,9). En las células epiteliales nasales humanas, RV redujo la expresión de E-cadherina a nivel de ARNm y proteína (10).
Además de tener efectos sobre la función de barrera, el RV induce respuestas proinflamatorias (11,12,13,14). Como respuesta natural a las infecciones, las células epiteliales de las vías respiratorias superiores secretan moco y también interferones de tipo I y III.15,16,17,18). Todas estas respuestas son protectoras, pero si son exageradas o defectuosas, como se observa en la EPOC y el asma, respectivamente, pueden provocar inflamación pulmonar y obstrucción de las vías respiratorias.
Aunque las vacunas contra algunos virus respiratorios son eficaces, los virus mutan con frecuencia y esto puede afectar significativamente la eficacia de la vacuna. Los medicamentos recetados o de venta libre disponibles para tratar las infecciones virales de las vías respiratorias superiores pueden tener efectos secundarios. Los compuestos naturales extraídos de plantas están ganando popularidad para tratar infecciones respiratorias comunes. Anteriormente, Euphorbium compositum SN (ECSN6), un medicamento multicomponente y multiobjetivo elaborado a partir de ingredientes naturales, tiene una larga historia de uso como terapia de apoyo para la rinitis de diversos orígenes, incluida la rinitis infecciosa y alérgica, la sinusitis aguda o crónica y la rinitis seca. Se demostró que ECSN6 alivia los síntomas respiratorios en pacientes con sinusitis y rinitis en estudios no intervencionistas (19). Además, la investigación básica ha revelado una débil actividad antiviral de ECSN6 contra los virus del tracto respiratorio superior, como el virus del herpes simple tipo 1 y el virus respiratorio sincitial (20). Por lo tanto, para aprender más sobre el modo de acción que puede explicar al menos algunos de los efectos clínicos favorables establecidos de ECSN6, intentamos investigar el efecto potencial de ECSN6 en la red de barrera mucosa durante la infección por VD.
Utilizamos cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias diferenciadas mucociliares fisiológicamente relevantes establecidos a partir de células basales nasales o traqueales humanas sanas. Confirmamos nuestros resultados en un modelo de ratón con infección intranasal del VD. Utilizamos RV-A1 que se une a miembros de la familia de receptores de LDL y estimula respuestas proinflamatorias en células epiteliales de las vías respiratorias tanto humanas como de ratones e infecta las vías respiratorias de los ratones (21). Los resultados clave se confirmaron con RV16 en el sistema modelo in vitro porque este serotipo se une específicamente a la ICAM-1 humana y no infecta las vías respiratorias del ratón.
Métodos
Preparación de existencias de vehículos recreativos.
Las células H1HeLa, RV-A1 y RV16 se adquirieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). RV se propagó en células H1HeLa y se purificó parcialmente mediante ultrafiltración usando una membrana de corte de 100 kDa como se describió anteriormente y se almacenó a -80 ° C (22). La concentración de RV en las reservas se determinó mediante ensayo de placa (13). El medio gastado de células H1HeLa no infectadas se sometió a ultrafiltración y se utilizó como control simulado.
Medicación del estudio
La solución de aerosol nasal ECSN6 y el control de placebo fueron fabricados y embotellados en frascos de vidrio de 20 ml por Synerlab Pharmaster (Erstein, Francia) en nombre de Heel GmbH (Baden-Baden, Alemania) de acuerdo con los estándares internacionales de buenas prácticas de fabricación y la farmacopea reconocida. El medicamento del estudio fue empaquetado, etiquetado y enviado por Heel GmbH, Alemania. Los ingredientes activos de ECSN6 se enumeran en la tabla complementaria. 1. Los excipientes incluyen fosfato disódico dihidrato, cloruro de sodio, dihidrógenofosfato de sodio dihidrato y agua para preparaciones inyectables. Debido a los ingredientes activos, hay un máximo de 0,22 % de EtOH residual. El placebo contenía fosfato disódico dihidrato, cloruro de sodio, dihidrógenofosfato de sodio dihidrato, EtOH residual al 0,22 % y agua para preparaciones inyectables. En todos los experimentos, se utilizó placebo para diluir el 100 % de la solución de aerosol nasal ECSN6 original al 20 % y al 40 % para los estudios in vitro y para los estudios in vivo, respectivamente. Estas diluciones se prepararon recientemente justo antes de usar el medicamento del estudio en los experimentos.
Infección y tratamiento de cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias.
Se aislaron células basales/madre de las vías respiratorias de la tráquea de 7 pulmones sanos de no fumadores que fueron rechazados para trasplante de pulmón. Para cada experimento se utilizaron células de 2 a 3 donantes y se realizaron réplicas biológicas según lo indicado para cada experimento. También recogimos cepillados nasales de 2 no fumadores sanos. La recolección de cepillados tráqueales y nasales y el uso de células basales de las vías respiratorias fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Temple, Filadelfia, PA (4407) y la Universidad de Michigan Ann Arbor, MI (HUM00052806). Las células basales aisladas de la tráquea se expandieron en medio de vida bronquial (Lifeline Cell Technologies, Frederick, MD) y se cultivaron en la interfaz aire/líquido en transwells de 6,5 a 12 mm para promover la diferenciación mucociliar como se describe (23,24,25). Se sembraron células de cepillados nasales en pocillos recubiertos con colágeno y fibronectina humana, y se cultivaron en medio de vida bronquial, modificado con 25 ng/ml de EGF hasta que las células alcanzaron una confluencia del 80 %. Luego, las células se recogieron y se cultivaron en transwells de 6,5 mm similares a las células basales traqueales.
El día de la infección, los transwells que contenían células epiteliales diferenciadas mucociliares se transfirieron a nuevas placas receptoras que contenían medio de diferenciación fresco sin rojo de fenol. La superficie apical de los cultivos diferenciados mucociliares se lavó con PBS para eliminar el moco secretado y se midió el TER. Las culturas eran entonces…
