Resumen
La lesión pulmonar aguda (LPA) se caracteriza por una reacción inflamatoria no regulada, que a menudo conduce a una morbilidad grave y, en última instancia, a la muerte. Se ha demostrado que la inflamación excesiva causada por la polarización de los macrófagos M1 y la piroptosis tiene un papel fundamental en la LPA. Un estudio reciente sugiere que la reprogramación glucolítica es importante en la regulación de la polarización de los macrófagos y la piroptosis. Sin embargo, aún no se han identificado los procesos particulares que subyacen a la LPA. En este estudio, establecimos un modelo de LPA inducido por lipopolisacárido (LPS) y demostramos que el bloqueo de la glucólisis mediante el uso de 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) disminuyó significativamente la expresión de los marcadores de macrófagos M1 y los genes relacionados con la piroptosis, lo que fue consistente con los resultados in vitro. Además, nuestra investigación ha revelado que la fosfoglicerato quinasa 1 (PGK1), una enzima esencial en la vía de la glucólisis, interactúa con la proteína 3 que contiene los dominios NOD, LRR y pirina (NLRP3). Descubrimos que la estimulación con LPS mejora la combinación de PGK1 y NLRP3 tanto in vivo como in vitro. Curiosamente, la ausencia de PGK1 reduce el nivel de fosforilación de NLRP3. Basándonos en estudios in vitro con macrófagos derivados de médula ósea de ratones (BMDM), confirmamos además que siPGK1 desempeña un papel protector al inhibir la piroptosis de los macrófagos y la polarización de los macrófagos M1. El inhibidor de PGK1 NG52 suprime la aparición de inflamación excesiva en ALI. En general, es plausible considerar una estrategia terapéutica que se centre en modular la relación entre PGK1 y NLRP3 como un medio para mitigar la activación de los macrófagos inflamatorios en ALI.
Introducción
La lesión pulmonar aguda (LPA) es un síndrome respiratorio progresivo con una morbilidad y mortalidad significativas en el mundo (1). En la actualidad, todavía se hace hincapié en el tratamiento sintomático y de apoyo de la ALI (2). Por lo tanto, es de gran importancia para nosotros encontrar formas efectivas de atenuar la abrumadora inflamación pulmonar en la ALI. Es bien sabido que los macrófagos alveolares desempeñan un papel fundamental en el reconocimiento y la eliminación de patógenos (3). Los macrófagos activados intensificarían la cascada de inflamación pulmonar al liberar citocinas proinflamatorias (4). Aunque la sobreactivación de los macrófagos desempeña un papel crucial en la aparición y progresión de la ALI, los mecanismos responsables de la activación de los macrófagos en la ALI siguen siendo en gran medida desconocidos.
En diversos microambientes, los macrófagos exhiben dos categorías principales: M1 proinflamatorio inducido por LPS y M2 antiinflamatorio inducido por IL4/IL13. Los macrófagos están polarizados principalmente hacia el fenotipo M1 en la progresión de ALI (5). Además, la evidencia acumulada también sugiere que la piroptosis de los macrófagos puede contribuir a la inflamación excesiva en la ALI. La piroptosis es un tipo de muerte celular proinflamatoria que se caracteriza por la formación de poros en la membrana plasmática, que es iniciada por los inflamasomas (6). El inflamasoma NLRP3 es actualmente el inflamasoma mejor caracterizado y conduce a la maduración de las citocinas proinflamatorias como IL-1β e IL-18 (7). Además, estudios recientes han demostrado que la piroptosis está asociada con la polarización de los macrófagos (8).
Resulta interesante destacar que cada vez hay más evidencias que sugieren que la alteración metabólica celular que se produce en las células inmunitarias tiene un gran impacto en su función. Se encontró una glucólisis aeróbica elevada en los macrófagos proinflamatorios (9). Se ha descubierto que una mayor glucólisis en ALI puede influir en la polarización de los macrófagos y la activación del inflamasoma NLRP3 (10, 11). El bloqueo de la glucólisis podría mejorar parcialmente la hiperactivación de la inflamación en la ALI inducida por LPS (12). Por lo tanto, es urgente lograr una comprensión más específica de los mecanismos que subyacen a la reprogramación glucolítica en la polarización de los macrófagos y la piroptosis, y esto puede proporcionar un nuevo objetivo terapéutico para la cascada inflamatoria en la ALI.
Entre los diversos genes asociados a la glucólisis, la fosfoglicerato quinasa 1 (PGK1) destaca por su potencial de doble funcionalidad. PGK1 es la primera enzima productora de ATP en la vía glucolítica a través de la transformación del 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG) en 3-fosfoglicerato (3-PG) (13, 14).En consonancia con su sobreexpresión en varios cánceres humanos, PGK1 es un factor regulador crítico de la progresión tumoral (15). Además de su función como enzima metabólica, estudios recientes han revelado que la PGK1 está involucrada en muchos procesos biológicos como quinasa. Además, se han publicado numerosos trabajos que indican que el inhibidor de la PGK1 ejerce un potente efecto antiinflamatorio (16). Sin embargo, el papel preciso de la PGK1 en la inducción de la inflamación en la ALI aún no se comprende bien.
Por lo tanto, el estudio actual fue diseñado con el objetivo de examinar las siguientes preguntas de investigación: 1) ¿La reprogramación glucolítica regula la polarización de los macrófagos y la piroptosis en la ALI? 2) ¿Puede la enzima glucolítica PGK1 regular la inflamación excesiva causada por la activación de los macrófagos M1 y la piroptosis en la ALI? 3) ¿Cuáles son los mecanismos fundamentales que subyacen a la relación entre PGK1 y NLRP3 en la ALI?
Métodos y materiales
Animales de experimentación y modelo de lesión pulmonar aguda
Los ratones machos C57BL/6J de tipo salvaje (WT), de 6 a 8 semanas de edad, se obtuvieron de Shanghai Slack Experiment Co., Ltd. Estos ratones se alojaron en un entorno controlado y libre de patógenos en el Laboratorio Animal del Hospital Xinhua en Shanghái, China. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética del Hospital Xinhua, afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (N.º de aprobación, XHEC-F-2023-067). El modelo de lesión pulmonar aguda (ALI) se indujo mediante la administración intranasal de LPS (de E. coli O111:B4, Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) a una dosis de 5 mg/kg durante 24 h. El grupo de control recibió un volumen equivalente del disolvente. El inhibidor de la glucólisis 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) (1 g/kg, HY-13966, MCE, EE. UU.) se administró mediante inyección intraperitoneal 1 h antes del tratamiento con LPS como se describió previamente (12). A los ratones se les administró NG52(HY-15154, MCE, EE. UU.) por vía intragástrica en dosis de 50, 100 o 150 mg/kg 1 h antes del tratamiento con LPS (17, 18). Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados y sometidos a una serie de análisis como se describe a continuación.
Análisis histológico del pulmón y puntuación de la lesión inflamatoria
Los lóbulos pulmonares superiores derechos de los ratones se fijaron en paraformaldehído al 4% durante la noche, luego se incluyeron en parafina, se cortaron y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Se empleó un sistema de puntuación predefinido para semicuantificar el grado de lesión pulmonar histológica (19). El sistema comprendió cuatro parámetros: engrosamiento del tabique alveolar, inflamación, hemorragia y edema, con puntuaciones de gravedad que variaban de 0 a 4.
Cultivo y tratamiento de BMDM
Se sacrificaron ratones de 6 semanas de edad de forma humanitaria. Luego se extrajo la médula ósea de la tibia y el peroné. Las células se cultivaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contenía 20 % de sobrenadante L929 y 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S). El séptimo día, los BMDM se trataron con LPS (100 ng/ml) para el modelo de polarización M1. Y las células se preestimularon con LPS (500 ng/ml) durante 4 h. A esto le siguió la estimulación con ATP (5 mM, MCE, EE. UU.) para el modelo de piroptosis. Para evaluar el impacto de la glucólisis en los macrófagos, administramos 2-DG (5 mM, HY-13966, MCE, EE. UU.) a las células antes de estimularlas. El ARN interferente pequeño (siRNA) fue fabricado por Gene Pharma (Shanghai, China). La secuencia de sentido de siPGK1 es 5′-GCGCUAAAGUUGCAGACAATT-3′. La transfección de siPGK1 se llevó a cabo utilizando el reactivo de transfección de ARNip/miARN Rfect (Baidai biotechnology, Changzhou, China) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La eficacia de silenciamiento de los genes diana se confirmó mediante análisis Western blot.
Western blot (WB)
Se recogieron los tejidos y las células pulmonares y se lisaron utilizando un tampón de lisis RIPA. Posteriormente, se realizó una centrifugación y las muestras se desnaturalizaron utilizando un tampón de carga. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 10-12,5 % y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes a 4 ℃ durante la noche. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-NLRP3 (CST, D4D8T), anti-GSDMD (abcam, ab209845), anti-IL-1β (santa cruz, sc-12742), anti-HK2 (santa cruz, sc-130358), anti-LDHA (Proteintech, 19987-1-AP), anti-PKM2 (abclonal, A20991), anti-iNOS (CST, 13120), anti-PGK1 (Proteintech, 17811-1-AP; santa cruz, sc-130335), anti-α-Tubulin (Proteintech, 11224-1-AP). Al día siguiente, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios (Beyotime, China) a temperatura ambiente durante 1 h. Las bandas de proteína se visualizaron utilizando un reactivo de quimioluminiscencia mejorada y la expresión relativa de proteína se cuantificó utilizando el sistema Image J.
PCR cuantitativa en tiempo real
El ARN total se extrajo utilizando TRIzol (TAKARA, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó Prime Script RT Master Mix (TAKARA, Japón) para la síntesis de ADNc y, posteriormente, se amplificó con Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus) (YEASEN, China) en el sistema QuantStudio™ 3 (Applied Biosystems). Los niveles de expresión relativa se calcularon utilizando el método 2^-ΔΔCt. Las secuencias de cebadores se proporcionan en la Tabla 1.Secuencias de los primers.
Tabla 1 Secuencias de los cebadoresMesa de tamaño completoAnálisis por citometría de flujo
Se obtuvieron 1 × 10^6 células mediante centrifugación y posteriormente se resuspendieron en PBS para su análisis mediante citometría de flujo. Se emplearon anticuerpos anti-CD86 (BioLegend, EE. UU.) y anti-F4/80 (BioLegend, EE. UU.) para la tinción fluorescente siguiendo las instrucciones del fabricante. Las suspensiones celulares, tras el período de incubación, se sometieron a análisis utilizando el citómetro de flujo CytoFLEX (Beckman, EE. UU.). Los resultados se analizaron utilizando el software FlowJo v10 (Tree Star Inc.).
