Resumen
Antecedentes
La silicosis es una enfermedad pulmonar ocupacional progresiva y a menudo fatal. El inflamasoma NLRP3 es un sensor inmune innato que se activa por la sílice. La evidencia acumulada ha implicado un papel para NLRP3 en la patogénesis de silicosis. En este estudio, dilucidamos mecánicamente la contribución de NLRP3 a la enfermedad pulmonar inducida por sílice.
Métodos
El papel in vivo de NLRP3 se investigó después del suministro intranasal de 2 mg de sílice o diluyente solo para ratones de tipo salvaje, reportero NLRP3 y deficientes en NLRP3. La expresión de proteínas, la inflamación e histopatología se analizaron en el pulmón.
Resultados
La administración intranasal de sílice recapituló las características patológicas clave de la silicosis humana, incluida la inflamación no resolución, la formación de nódulos silicóticos y la fibrosis pulmonar difusa. Un ratón reportero colocado bajo el promotor nativo de NLRP3 reveló la sílice de sílice rápidamente regulada por la expresión de NLRP3 en todo el pulmón. Los ratones deficientes en NLRP3 mostraron marcadas reducciones tempranas en los niveles de IL-1β e IL-18 inducidos por sílice en las vías respiratorias. Además, la deficiencia de NLRP3 deterioró la infiltración rápida de los neutrófilos Siglec-F-F-F+ fibróticos convencionales, que se correlacionaron con niveles reducidos de elastasa de neutrófilos. La deficiencia en la inflamación aguda mediada por NLRP3 se correlacionó con la expresión de actina beta de crecimiento transformador pulmonar significativamente reducido y la expresión de actina del músculo liso alfa, daño tisular y fibrosis en la fase crónica de la progresión de la enfermedad. Es importante destacar que esto incluyó un tamaño reducido del nódulo silicótico y la celularidad.
Conclusiones
Estos hallazgos destacan un papel perjudicial importante para el inflamasoma NLRP3 en la conducción de la infiltración de neutrófilos pulmonares inducidos por sílice, la activación de miofibroblastos mediada por TGFβ, daño tisular y fibrosis.
Introducción
La inhalación de la sílice cristalina de cuarzo puede conducir al desarrollo de la silicosis, una enfermedad pulmonar devastadora caracterizada por inflamación no resolución, daño tisular y fibrosis (1). A pesar de la implementación de los estándares de seguridad en las industrias, como la minería, la fabricación y la construcción, la silicosis sigue siendo una carga global frecuente (2). El rápido deterioro de los pacientes después de un diagnóstico de silicosis, incluidos algunos de hasta 25 años (3), ha planteado importantes preocupaciones de salud pública. Esto ha impulsado las revisiones a las regulaciones globales de seguridad en el lugar de trabajo. Sin embargo, el estándar para la exposición de sílice cristalina respirable aceptable en India permanece de tres a seis veces mayor que en países como los Estados Unidos de América y Australia (4). En respuesta a esta creciente crisis de salud, a partir de julio de 2024, Australia ordenó el informe obligatorio de casos de silicosis e implementó una prohibición de la fabricación, el suministro y el uso de benchops de piedra diseñados, que pueden estar compuestas por hasta el 95% de sílice cristalina (5). El programa global para la eliminación de silicosis, establecido por la Organización Internacional del Trabajo y la Organización Mundial de la Salud, tiene como objetivo eliminar la silicosis en todo el mundo para 2030 (6). A pesar del establecimiento de objetivos e iniciativas globales, actualmente no hay tratamientos efectivos para la silicosis debido a su naturaleza irreversible, siendo el trasplante de pulmón la única opción viable. El manejo de la enfermedad es en gran medida de apoyo, con un enfoque en aliviar los síntomas y prevenir una mayor exposición a sílice (7).
La silicosis aguda se desarrolla dentro de unos años de exposición a cantidades extremadamente altas de polvo de sílice y a menudo progresa a la proteinosis alveolar pulmonar secundaria (8). En pacientes con silicosis aguda, los pulmones muestran alveolitis severa, inflamación intersticial y la formación de pequeños nódulos, que son características (9, 10). La inhalación del polvo de sílice inicia un ciclo de inflamación persistente y fibrosis crónica en etapas avanzadas de silicosis, lo que conduce a insuficiencia respiratoria y, en la mayoría de los casos, es fatal. Las partículas de sílice están envueltas por macrófagos alveolares residentes, lo que lleva a la activación de las vías inflamatorias aguas abajo (1). La acumulación de sílice dentro de estas células perjudica su capacidad para despejar las partículas, lo que resulta en la exacerbación y la preservación de las respuestas inflamatorias. Esta respuesta crónica promueve la formación de nódulos silicóticos, una característica distintiva clave de la silicosis severa (11, 12). Los nódulos silicóticos se componen inicialmente de agregados de células inflamatorias, pero se vuelven más fibróticas a medida que avanza la enfermedad, y finalmente forman densas espirales de fibras de colágeno. La lesión tisular repetida causada por la exposición a la sílice conduce a la expansión y eventual coalescencia de nódulos silicóticos para establecer áreas de fibrosis masiva progresiva.
El NLRP3 (dominio de unión a nucleótidos y el dominio de pirina repetido rico en leucina que contiene 3) inflamasoma es una unidad multiproteína responsable de la detección de varias señales de estrés celular, incluidos los irritantes ambientales como el polvo de sílice ((1, 13). Específicamente, se ha demostrado que la sílice causa daño lisosómico y ruptura y disfunción mitocondrial, que puede ser detectada por NLRP3 (14). Curiosamente, los silanoles casi libres (NF) que se encuentran en la superficie de las partículas de sílice pueden dañar los fagolisosomas, inducir respuestas proinflamatorias dependientes de NLRP3 y impulsar la toxicidad (15, 16). Tras la activación, NLRP3 interactúa con la proteína ASC del adaptador (proteína similar a la motos asociada a la apoptosis que contiene el dominio de la tarjeta) para reclutar la cisteína proteasa caspasa-1 para formar un complejo de proteínas oligoméricas (1, 17). La autocatálisis de caspasa-1 promueve posteriormente la maduración enzimática de pro-IL-1β y pro-IL-18 a sus formas bioactivas, IL-1β e IL-18, respectivamente. La piroptosis inducida por sílice, una forma lítica de muerte celular, también implica la escisión mediada por inflamasoma NLRP3 de la gasdermina D (GSDMD) formadora de poros (GSDMD) por caspasa-1 (18). La inserción del N-terminal activo de GSDMD en la membrana plasmática da como resultado la formación de poros para facilitar la liberación de potentes citocinas proinflamatorias IL-1β e IL-18 (19, 20). La ruptura de la membrana plasmática eventual promueve la liberación de contenidos celulares, incluidos los patrones moleculares asociados al daño (DAMPS), creando así un bucle de inflamación de retroalimentación positiva (21, 22). También se ha propuesto que las partículas de sílice pueden liberarse durante la lisis celular y volver a ceder por las células circundantes en un proceso cíclico (23).
Los modelos animales se han utilizado para recapitular las principales características de la silicosis humana (24, 25). Un número limitado de estudios ha implicado un papel in vivo para NLRP3 en la silicosis, con ratones con deficiencia de genes que muestran una reducción de la patología del tejido bruto, incluida la inflamación y la fibrosis a los 2-3 meses (26, 27). Sin embargo, las respuestas dependientes de NLRP3 en el pulmón actualmente no se caracterizan bien en el contexto de la silicosis, y se requiere más trabajo para establecer mecánicamente la importancia de NLRP3 en la patogénesis de la silicosis.
En este estudio, investigamos un papel para NLRP3 en silicosis aguda y crónica para proporcionar información más clara sobre la patogénesis y el potencial de NLRP3 como un objetivo terapéutico. Aquí, demostramos que la administración intranasal de 2 mg de sílice induce las características patológicas clave de la silicosis observadas en los humanos, incluida la formación de nódulos silicóticos. Utilizando un nuevo ratón reportero, identificamos que la entrega de sílice reguló la expresión de NLRP3 en todo el pulmón, particularmente en los alvéolos en el día 3. En particular, la deficiencia de NLRP3 redujo significativamente las respuestas tempranas de IL-1β e IL-18 en las vías respiratorias. Además, la deficiencia de NLRP3 deterioró la infiltración de neutrófilos Siglec-F-F-F-F-F-F-F-F-F-F+, así como una población única de neutrófilos Siglec-F+, que se correlacionó con la actividad reducida de la elastasa de neutrófilos. La inflamación temprana mediada por NLRP3 precedió a la fibrosis pulmonar en etapa posterior marcada por la deposición de colágeno y la formación de nódulos silicóticos. Por último, los ratones deficientes en NLRP3 mostraron fibrosis reducida en el día 28 después del suministro de sílice. Sugestivo de la disminución del factor de crecimiento transformador β (TGFβ) activación de miofibroblastos mediada por NLRP3, la deficiencia redujo la expresión de actina del músculo liso alfa (α-SMA) y TGFβ maduro en el pulmón. Es importante destacar que la deleción global de NLRP3 condujo a una reducción del tamaño y celularidad del nódulo silicótico en el día 28. Juntos, estos hallazgos subrayan un papel perjudicial crítico para el inflamasoma NLRP3 al impulsar la inflamación inducida por sílice y el daño pulmonar y la fibrosis no resuelto.
Métodos
Animales
WildType, NLRP3-/-y reportero NLRP3-CHCI (ratones McItrine-NLRP3-Mcherry) C57BL/6J (hombre y mujer, 6-14 semanas) se alojaron en condiciones específicas libres de patógenos en el recinto traduccional de Monash Health (Clayton, Victoria, Australia). Los ratones reporteros NLRP3-CHCI en un fondo C57BL/6J fueron generados por la metodología de trampa de genes (28, 29) en células madre embrionarias de ratón con un vector que contiene el gen NLRP3 flanqueado por Mcitrine y Mcherry (por lo tanto llamado NLRP3-CHCI– IE, McItrine-NLRP3-Mcherry).
Modelo de ratón de enfermedad pulmonar inducida por sílice
La sílice natural y fina (Min-U-Sil-5,> 99% de pureza y tamaño de partícula de ≤ 5 μm) fue amablemente proporcionada por la sílice de EE. UU. (Katy, EE. UU.). Los ratones se anestesiaron ligeramente con isoflurano y se administraron por vía intranasal 2 mg de sílice en 50 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS), como se describió anteriormente ((30). Los ratones de control recibieron PBS solos.
Los ratones se pesaron 3 veces a la semana, y los ratones sacrificados se sacrificaron mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio. El lavado broncoalveolar (BAL) se obtuvo inmediatamente al enjuagar el pulmón 3 veces con 1 ml de PBS. El fluido BAL se recogió después de la centrifugación para el análisis de citoquinas, y los gránulos de células BAL se analizaron por citometría de ctopina o flujo. Los tejidos pulmonares, la recolección posterior a la balanza, se eliminaron e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido para el análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas. Además, en una cohorte separada de ratones, los tejidos pulmonares enteros fueron fijados con formalina y …
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