Resumen
Antecedentes y propósitos
Los receptores hepáticos X (LXR) son receptores nucleares especializados esenciales para mantener la homeostasis del colesterol; modular la actividad de LXR podría tener potencial terapéutico en enfermedades pulmonares. La displasia broncopulmonar (DBP) es una enfermedad pulmonar crónica caracterizada por un desarrollo alveolar deficiente, en el que la apoptosis de las células epiteliales alveolares es un factor contribuyente clave. La investigación actual se centra en explorar el mecanismo potencial por el cual la vía LXR regula la apoptosis de las células epiteliales alveolares tipo II en respuesta a la exposición a la hiperoxia.
Métodos
Se inscribieron bebés con TLP y bebés prematuros sin TLP para medir los niveles séricos de colesterol total (CT). Para investigar más a fondo el papel del metabolismo del colesterol en la TLP, se estableció un modelo de TLP en ratas neonatales y se realizaron estudios in vitro utilizando células epiteliales de pulmón de ratón (MLE12). Estos experimentos tenían como objetivo explorar el impacto de la hiperoxia en el metabolismo del colesterol y evaluar los efectos de la intervención con agonistas de LXR.
Resultados
Se observaron niveles elevados de CT en suero en bebés con BPD, acompañados de sobrecarga de colesterol pulmonar en ratas con BPD. La exposición a la hiperoxia también provocó la acumulación de colesterol intracelular en las células MLE12, lo que puede atribuirse a la vía de señalización LXR regulada negativamente. La activación de la vía LXR evitó la apoptosis y la disfunción mitocondrial en las células MLE12. En ratas BPD, la intervención con el agonista LXR restauró la arquitectura alveolar y redujo la apoptosis de las células epiteliales alveolares tipo II, que se asoció con una disminución del estrés oxidativo y la acumulación de colesterol en los pulmones.
Conclusiones
La alteración del metabolismo del colesterol y la alteración de la homeostasis en bebés prematuros pueden contribuir al desarrollo del TLP. Dirigirse a la señalización LXR puede proporcionar objetivos terapéuticos potenciales en el TLP.
Número de ensayo clínico
No aplicable.
Introducción
La displasia broncopulmonar (DBP) es una afección respiratoria crónica prevalente que afecta principalmente a bebés con muy bajo peso al nacer y a bebés extremadamente prematuros.1). A pesar de los avances en la atención neonatal, la incidencia del TLP sigue siendo alta, con intervenciones preventivas o terapéuticas efectivas limitadas.1). Los bebés con TLP a menudo experimentan resultados adversos a largo plazo, incluyendo aumento de infecciones, deterioro de la función pulmonar, hipertensión pulmonar, desarrollo neurológico anormal y altas tasas de mortalidad.2). La etiología y los mecanismos exactos del TLP no están completamente dilucidados, pero se cree que está relacionado con una parada en la formación alveolar y la angiogénesis.3). Los tratamientos farmacológicos actuales sólo proporcionan alivio sintomático en lugar de promover la recuperación pulmonar. Está bien demostrado que el desarrollo de TLP está asociado con la suplementación de oxígeno y la ventilación mecánica, lo que puede provocar estrés oxidativo e inflamación, así como lesión y muerte de las células pulmonares.4). Las células epiteliales alveolares tipo I (ATI) y tipo II (ATII) que recubren los alvéolos se lesionan cuando se exponen a la hiperoxia (5). La regeneración alveolar está dirigida principalmente por ATII, que tiene la capacidad de autorrenovarse y da lugar a ATI después de una lesión pulmonar.6). La apoptosis es una vía de muerte celular altamente regulada y conservada evolutivamente; investigaciones anteriores han demostrado que la apoptosis excesiva inducida por hiperoxia en células ATII juega un papel importante en el desarrollo de BPD (7, 8). Por lo tanto, los cambios en el microambiente pulmonar después de la hiperoxia pueden complicar el curso de la DBP al inducir la apoptosis de las células ATII y obstaculizar el crecimiento alveolar.9).
El estrés oxidativo está estrechamente relacionado con alteraciones en el metabolismo del colesterol (10). Los estudios han encontrado que los bebés prematuros generalmente presentan niveles más altos de colesterol en la sangre en comparación con sus contrapartes a término (11). Los niveles elevados de colesterol, o hipercolesterolemia, pueden provocar la acumulación de colesterol en varios tipos de células (12). Investigaciones recientes sugieren que el colesterol afecta las respuestas inflamatorias y mitocondriales en las células epiteliales del pulmón en enfermedades pulmonares, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (12). El transporte inverso de colesterol (RCT) es un proceso que media en la eliminación del exceso de colesterol de los tejidos periféricos.13). Los estudios en animales han informado que los ratones que carecen del transportador ABCA1 del casete de unión a ATP (ABC), un actor importante en los ECA, exhibieron sobrecarga de colesterol, morfología y fisiología pulmonar anormal y un fenotipo proinflamatorio (14). El receptor Hígado X (LXR), reconocido como un regulador clave para RCT (15), ha sido identificado en varios estudios como un objetivo prometedor para mejorar los resultados pulmonares en enfermedades pulmonares cuando se activa con agonistas de LXR (16, 17).
En este estudio, presentamos por primera vez evidencia de que la exposición excesiva a oxígeno se asociaba con un trastorno del metabolismo del colesterol en los primeros años de vida de los pacientes con TLP y planteamos una nueva hipótesis según la cual la hiperoxia afecta negativamente a la homeostasis del colesterol pulmonar, lo que conduce a estrés oxidativo y apoptosis de ATII, que puede aliviarse mediante la activación de la vía LXR.
Métodos
Población de estudio
En este estudio se inscribieron un total de 65 bebés nacidos con <32 semanas de edad gestacional (EG), y se obtuvo el consentimiento informado de los padres para cada participante. Los bebés fueron seguidos hasta las 36 semanas de edad posmenstrual. La definición de TLP fue según el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano en 2018 (18). Un bebé prematuro (nacido con <32 semanas de gestación) con DBP se caracterizó por una enfermedad pulmonar parenquimatosa persistente con evidencia radiográfica. A las 36 semanas de edad posmenstrual, el bebé necesitó asistencia respiratoria adicional, con una fracción de inspiración O2 (FiO2) ≥ 21%, durante 3 días sucesivos, para mantener la saturación arterial de oxígeno entre 90-95%.18).
Establecimiento e intervención del modelo de rata BPD.
Se compraron ratas Sprague-Dawley (SD) que tenían entre 6 y 8 semanas de edad en Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China). Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las pautas de los NIH sobre el tratamiento y utilización de animales de laboratorio, aprobadas por la Universidad de Jiangnan (aprobación No. JN. No20240430S0241230 (216)). Las crías de ratas recién nacidas fueron sometidas a 85% de O2 (grupo BPD) o 21% de O2 en aire ambiente (grupo RA) desde el nacimiento (PN0) hasta el día posnatal 14 (PN14). En PN8, las ratas recién nacidas del grupo BPD se dividieron en 2 grupos mediante intervención: inyección intraperitoneal con PBS en PN8 – PN14 (grupo BPD + PBS) e inyección intraperitoneal con agonista LXR T0901317 (Cayman Chemical, Cat#71810) grupo (TLP + grupo T09). Según trabajos anteriores, T0901317 se disolvió en DMSO y se administró por vía intraperitoneal con una dosis de 25 mg/kg como se informó en otras enfermedades pulmonares (19,20,21,22). Se tiñeron secciones de cuatro micrómetros de tejido pulmonar fijado con formalina e incluido en parafina con hematoxilina y eosina (HE) para su examen histopatológico. Las secciones fueron examinadas bajo microscopía óptica por dos investigadores independientes que desconocían los grupos de tratamiento. Las concentraciones de colesterol total (CT) se cuantificaron utilizando un kit de colesterol comercial (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Cat#A111-1-1, Nanjing, China). Se utilizaron tejidos pulmonares para determinar el CT siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos finales se presentaron como contenidos de CT en 1 mg de proteína (mmol/mg pro).
Estudios in vitro
Se cultivaron células epiteliales de pulmón murino: células MLE12 (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) en DMEM (Gibco, Thermo Fisher Scientifc, Inc.) suplementadas con suero bovino fetal al 10 % (Yeasen, Shanghai, China) y se expusieron a O2 al 85 %. (grupo HYX) o aire ambiente con O2 al 21% (grupo NOX) durante 24 a 48 h. Las células MLE12 se trataron con colesterol (MCE, n.º de catálogo HY-N0322) en un entorno de NOX o estimulación con HYX. Las células MLE12 se trataron con o sin el agonista de LXR GW3965 (MCE, n.º de cat. HY-10627 A) bajo estimulación con HYX. La proliferación se evaluó mediante el ensayo CCK8 (Apex Bio, Cat#1018) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se recogieron y se incubaron en el tampón de unión que contenía 5 µl de anexina V-FITC y 10 µl de PI en la oscuridad durante 15 minutos para analizar el porcentaje de células apoptóticas mediante el microscopio de fluorescencia invertido, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MCE, Cat# HY-K1073). El potencial de membrana mitocondrial se midió utilizando el kit de detección de apoptosis JC-1 (MCE, Cat#HY-K0601), según las instrucciones del fabricante. Las células tratadas se tiñeron con JC-1 durante 20 min a 37 °C. A continuación, las células teñidas se recogieron y analizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Leica (Beckman Coulter Gallios, EE. UU.). La formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares se detectó utilizando diacetato de 2,7-diclorofluoresceína como sonda fluorescente, siguiendo las instrucciones del fabricante (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Cat#E004-1-1, Nanjing, China).
Análisis de transferencia Western y PCR cuantitativa en tiempo real.
Los lisados celulares se prepararon utilizando tampón RIPA y los niveles de proteína se determinaron con un kit de análisis de proteínas BCA (Apex Bio, Cat#K4101). Se fraccionaron aproximadamente 30 µg de proteínas en geles de SDS-PAGE al 10 % o 12 % y se transfirieron a membranas de PVDF. Después del bloqueo con leche desnatada al 5 %, las membranas se expusieron a anticuerpos primarios específicos durante la noche a 4 °C, incluidos anti-BAX (1:500, MCE, Cat#HY-P80929), anti-BCL2 (1:500, MCE, n.º de cat. HY-P80566), anti-VEGFA (1:500, MCE, n.º de cat. HY-P80929), anti-CD31 (1:5000, Proteintech, Cat# 11265-1-AP), anti-β-catenina (1:500, MCE, Cat#HY-P81261), anti-SPC (1:1000, Proteintech, Cat#10774-1 -AP), anti-LXRα (1:5000, Proteintech, Cat#60134-1-Ig) y anti-GAPDH (1:50000, Proteintech). Posteriormente, las membranas se trataron con anticuerpos secundarios apropiados durante 1 hora a temperatura ambiente, y las bandas de proteínas se detectaron y analizaron utilizando un sistema de imágenes de escaneo láser (Bio-Rad Molecular Imager, EE. UU.). Se utilizó el software Image J para calcular el valor de gris promedio de la proteína y el gris promedio…
