Resumen
La lesión pulmonar aguda (ALI) es una enfermedad respiratoria aguda grave que puede causar alteración de la barrera alveolar-capilar y edema pulmonar, insuficiencia respiratoria y síndrome de disfunción multiorgánica. Sin embargo, hasta ahora no existen fármacos eficaces en la clínica. GSK3179106 Se ha informado que puede aliviar el síndrome de estrés intestinal, pero el efecto protector de GSK3179106 sobre ALI no ha sido aclarado. El presente estudio evaluará la actividad farmacológica de GSK3179106 sobre la inflamación y la lesión pulmonar inducidas por lipopolisacáridos (LPS) y aclarar su mecanismo subyacente. encontramos que GSK3179106 La lesión pulmonar inducida por LPS se atenuó significativamente in vivo, acompañada de una infiltración inhibida de células inflamatorias y una expresión reducida de citocinas inflamatorias. Mientras tanto, GSK3179106 redujo de forma dependiente de la dosis la expresión de IL-6 inducida por LPS tanto en niveles de proteínas como de genes en macrófagos. Mecanísticamente, GSK3179106 podría inhibir la fosforilación de P38 MAPK inducida por LPS. Es importante destacar que los resultados mostraron que existe una combinación directa entre GSK3179106 y P38 MAPK. En conjunto, nuestros hallazgos no solo aclararon la actividad antiinflamatoria de GSK3179106 pero también descubrió sus nuevas indicaciones clínicas. Por lo tanto, compuesto GSK3179106 puede ser un candidato potencial para el tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas.
Introducción
La lesión pulmonar aguda (ALI), cuya característica principal es una lesión pulmonar inflamatoria difusa aguda, que produce un aumento de la permeabilidad capilar alveolar, edema alveolar y edema intersticial, es una enfermedad respiratoria clínica grave causada por sepsis, infección, shock, trauma y otros factores. (1, 2). Actualmente, la ventilación mecánica, la terapia con esteroides, el óxido nítrico o la oxigenación por membrana extracorpórea se utilizan generalmente para el tratamiento, pero no existen tratamientos efectivos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA).3, 4). La morbilidad y mortalidad de la ALI y su forma grave del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) siguen siendo muy altas (5, 6). Es urgente descubrir nuevos fármacos para el tratamiento de la ALI.
La tormenta de citocinas, caracterizada por la liberación de una gran cantidad de citocinas proinflamatorias, que están estrechamente relacionadas con el edema pulmonar, la insuficiencia orgánica múltiple y el shock, jugó un papel importante en la lesión pulmonar inflamatoria aguda (7, 8). Elevación persistente de citoquinas proinflamatorias, como la interleucina-6 (IL-6), IL-1β y el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, en suero y líquido de lavado broncoalveolar (BALF) asociado con el mal resultado del SDRA (9).Se ha informado que el tocilizumab, anticuerpo anti-receptor de IL-6, puede tratar eficazmente a pacientes con infección grave por COVID-19 mediante la inhibición de la transcripción del gen CRP y la supresión de la respuesta inflamatoria (10). Por lo tanto, se ha considerado que atacar las citoquinas proinflamatorias es un medio para tratar la hiperinflamación y la lesión pulmonar.
Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), incluida la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), p38 MAPK y la quinasa NH2-terminal c-Jun (JNK), se activan mediante diversos estímulos y median en procesos biológicos como la proliferación, la diferenciación y la inflamación. y supervivencia (11, 12). En la ALI inducida por lipopolisacáridos (LPS), las MAPK se fosforilan para activar la proteína activadora del factor de transcripción 1 (AP-1), promoviendo así la transcripción de citoquinas proinflamatorias, como IL-6, TNF-α, IL-1β et Alabama. (13, 14). Existen numerosas publicaciones en PMC-NCBI que han demostrado que la inhibición de la activación de la vía de señalización MAPK podría atenuar la ALI en estudios clínicos y de laboratorio. GSK3179106un inhibidor de multiquinasas, podría aliviar el síndrome de estrés intestinal mediante la atenuación de la hipersensibilidad visceral inflamatoria e inducida por el estrés al inhibir la actividad de la quinasa REorganizada durante la transfección (RET) en ratones (15, 16). Además de RET, también encontramos que GSK3179106 tenía una actividad inhibidora significativa contra varias quinasas dentro de la vía de señalización MAPK. Mientras GSK3179106 Los efectos inhibidores sobre las MAPK quinasas son evidentes, pero aún no está claro si puede modular la vía de señalización de MAPK y, por lo tanto, aliviar la ALI. Este estudio investigará la actividad farmacológica de GSK3179106 sobre ALI y aclarar su mecanismo molecular subyacente.
Materiales y métodos
reactivos
El LPS se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los anticuerpos para p-P38, P38, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P65, P65, IκB-α, p-STAT3 y STAT3 se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.). El kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de IL-6 de ratón se adquirió en eBioscience (San Diego, CA, EE. UU.). SB203580 se adquirió de Topscience Biochem Technology (Shanghai, China). SR11302 se adquirió de GlpBio (Montclair, EE. UU.). GSK3179106 se compró en Selleck (Texas, EE. UU.). Estudios in vivo, GSK3179106 se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) y luego se diluyó con aceite de oliva en concentraciones apropiadas (la concentración final de DMSO fue inferior al 1%). Estudios in vitro, GSK3179106 se disolvió en DMSO (la concentración final de DMSO fue inferior al 1‰) y se utilizó el mismo volumen de DMSO solo como control de vehículo.
cultivo celular
Los macrófagos J774A.1 (Procell CL-0370) fueron proporcionados amablemente por Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, China). Las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa (Gibco, Eggenstein, Alemania) con suero bovino fetal (FBS) al 10% y solución de penicilina-estreptomicina (P/S) al 1% a 37 °C en un ambiente humidificado. con un 5% de CO2.
Los macrófagos RAW264.7 adquiridos en el banco de células de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China) se cultivaron en DMEM con 10 % de FBS y 1 % de P/S.
Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron de Clonetics (San Diego, CA, EE. UU.) y se cultivaron en DMEM con 10 % de FBS y 1 % de P/S.
Cuidado y preparación de animales.
Se obtuvieron ratones macho C57BL/6 (18–20 g), de 6 a 8 semanas de edad, del Centro de Animales de la Universidad Médica de Wenzhou (Wenzhou, China). Los animales se alojaron a temperatura ambiente constante con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h y se alimentaron con una dieta estándar para roedores durante al menos 7 días antes de su uso. Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de animales fueron aprobados por el Comité de Bienestar y Política Animal de la Universidad Médica de Wenzhou (Documento de aprobación No. wydw2019-0438). Todos los animales recibieron atención humana según las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (EE. UU.).
Modelo ALI inducida por sepsis Treinta ratones C57BL/6 se separaron aleatoriamente en cinco grupos (n = 6 por grupo): grupo de control de vehículo (CON), grupo de sepsis inducida por LPS (LPS), grupo de dosis baja GSK3179106 grupo de sepsis pretratamiento (LPS + GSK 3), dosis alta GSK3179106 grupo de sepsis pretratamiento (LPS +GSK 6), y GSK3179106 grupo de pretratamiento únicamente ( GSK 6). Los ratones del grupo de LPS recibieron 10 mg/kg de LPS (100 μl, en solución salina) a través de la vena de la cola. Ratones en el LPS + GSK 3 y LPS+ GSK A 6 grupos se les administraron 3 mg/kg y 6 mg/kg. GSK3179106 (100 μL, 1% DMSO en aceite de oliva), respectivamente, mediante inyección intraperitoneal, 12 h y 1 h antes de la administración de 10 mg/kg de LPS (100 μL). ratones en elGSK El grupo 6 recibió 6 mg/kg.GSK3179106 (100 μL, 1% DMSO en aceite de oliva) mediante inyección intraperitoneal de 12 h y 1 h antes de la administración de solución salina. Los ratones del grupo CON recibieron un volumen equivalente de DMSO al 1% en aceite de oliva y solución salina. Los ratones fueron sacrificados bajo anestesia 12 h después de la administración de LPS mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral al 4%. Se recogieron muestras de sangre y BALF, y el tejido pulmonar se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C para su posterior análisis.
Modelo de ratón ALI Los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos (n = 5 por grupo): grupo control (CON), grupo ALI (ALI) y ALI +.GSK3179106 grupo (ALI +GSK 3). Los ratones del grupo ALI recibieron una instilación traqueal de 5 mg/kg de LPS (20 μl, en solución salina). Ratones en el ALI +GSK 3 grupos recibieron 3 mg/kgGSK3179106 (100 μL, 1% DMSO en aceite de oliva) mediante inyección intraperitoneal 12 h y 1 h antes de la administración de 5 mg/kg de LPS (20 μL). Los ratones del grupo CON recibieron un volumen equivalente de DMSO al 1% en aceite de oliva y solución salina. Los ratones fueron sacrificados bajo anestesia 6 h después de la administración de LPS mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral al 4%. Se recogieron muestras de sangre y BALF, y el tejido pulmonar se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C para su posterior análisis.
ensayo MTT
Se sembraron células J774A.1 y RAW264.7 en placas de 96 pocillos a una densidad de 0,8 x 104 células por pocillo. Las células fueron incubadas con diferentes concentraciones deGSK3179106 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 y 20 µM) durante 24 h. Luego, se agregaron 20 µl de MTT (5 mg/ml) a todos los pocillos y la placa se incubó en CO2 al 5 % a 37 °C durante 4 h más. Las células se disolvieron con 150 µl de DMSO y se analizaron en un lector de placas de múltiples pocillos a 490 nm.
Determinación de citocinas.
Los niveles de citoquinas proinflamatorias en medio de cultivo o BALF de ratón y suero se determinaron con kits de ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bioscience, San Diego, CA). La cantidad total de IL-6 en el medio se normalizó con respecto a la concentración de proteínas de los lisados.
Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
El ARN total se extrajo de células J774A.1, RAW264.7 y tejidos pulmonares (10 a 20 mg) utilizando TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Tanto la transcripción inversa como la PCR cuantitativa (qPCR) se llevaron a cabo utilizando IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, CA, EE. UU.). Se utilizaron sistemas de PCR en tiempo real QuantStudio®3 (ABI, CA, EE. UU.) para el análisis de qPCR. (10..1038/s41598-020–60618-x) Los cebadores de los genes diana se enumeran a continuación y se obtienen de Invitrogen (Shanghai, China). Cebador directo de TNF-α de ratón: 5′-CAGGGGCCACCACGCTCTTC-3′, cebador inverso de TNF-α de ratón: 5′- TTTGTGAGTGTGAGGGTCTGG-3′; Cebador directo de IL-6 de ratón: 5′- GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3 ′, cebador inverso de IL-6 de ratón: 5′- AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3 ′; Cebador directo de IL-1β de ratón: 5′- ACTCTTAGTCCTCGGCCA-3′, ratón…
