Resumen
Antecedentes
La sarcoidosis es una enfermedad granulomatosa heterogénea sin biomarcadores precisos de progresión de la enfermedad. Por lo tanto, perfilamos e integramos el metiloma del ADN, los ARNm y los microARN para identificar cambios moleculares asociados con la sarcoidosis y la progresión de la enfermedad que podrían arrojar luz sobre los mecanismos subyacentes de la enfermedad y los posibles biomarcadores.
Métodos
Se utilizaron células de lavado broncoalveolar de 64 sujetos con sarcoidosis y 16 controles sanos. Se realizó un perfil de metilación del ADN en matrices Illumina HumanMethylationEPIC, ARNm mediante secuenciación de ARN y microARN mediante secuenciación de ARN pequeño. Se ajustaron modelos lineales para evaluar el efecto del diagnóstico de sarcoidosis y el fenotipo de progresión, ajustando por edad, sexo, tabaquismo y componentes principales de los datos. Construimos un modelo multiómico supervisado utilizando un subconjunto de características de cada conjunto de datos.
Resultados
Identificamos 1.459 CpG, 64 ARNm y cinco miRNA asociados con la sarcoidosis en comparación con los controles y cuatro ARNm asociados con la progresión de la enfermedad. Nuestro modelo integrado enfatizó la prominencia de la vía PI3K/AKT1, que es importante en la función de las células T y mTOR. Nuevos genes relacionados con el sistema inmunitario y miRNA, incluidos LYST, RGS14, SLFN12L y hsa-miR-199b-5p, distinguieron la sarcoidosis de los controles. Nuestro modelo integrado también demostró la expresión/metilación diferencial de IL20RB, ABCC11, SFSWAP, AGBL4, miR-146a-3p y miR-378b entre la sarcoidosis no progresiva y la progresiva.
Conclusiones
Aprovechando el metiloma del ADN, el transcriptoma y la secuenciación de miRNA en células del LBA de sarcoidosis, detectamos cambios moleculares generalizados asociados con la enfermedad, muchos de los cuales están involucrados en la respuesta inmunitaria. Estas moléculas pueden servir como biomarcadores de diagnóstico/pronóstico y/o como dianas farmacológicas, aunque se requieren pruebas futuras para confirmarlo.
Introducción
La sarcoidosis es una enfermedad heterogénea caracterizada por una inflamación granulomatosa no caseosa que afecta de manera diferente a las personas de raza negra y a las mujeres.1). Los pulmones están afectados en más del 90% de los individuos (2). Las personas con sarcoidosis pulmonar pueden ser asintomáticas o demostrar remisión/resolución; sin embargo, la progresión puede resultar en deterioro y/o fibrosis pulmonar, la principal causa de mortalidad (3). El curso de la sarcoidosis pulmonar es impredecible y al menos el 25% de los pacientes desarrollan una enfermedad crónica o progresiva que requiere tratamiento (4). Actualmente se desconocen las causas subyacentes de la sarcoidosis, que se deben a una combinación de factores genéticos, ambientales e inmunológicos del huésped. Varias líneas de evidencia apuntan hacia un estímulo antigénico que incluye asociaciones de alelos HLA, patrones ambientales, estacionales y regionales, y una respuesta inmunitaria predominantemente Th1 en la que las células T CD4+ secretan IFN-γ y TNF-α (5). Además, las respuestas inmunes aberrantes y disfuncionales están asociadas con la sarcoidosis y respaldadas por estudios del transcriptoma de todo el genoma (6). Si bien estudios anteriores han dilucidado muchos de los factores que contribuyen al desarrollo y la progresión de la enfermedad, aún quedan muchas lagunas en el conocimiento.
Los mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN (ADNm) y los microARN (miARN) median la expresión génica, se modifican con la exposición y son dinámicos y reversibles, lo que los convierte en candidatos para la regulación génica en la sarcoidosis, así como en biomarcadores y dianas terapéuticas prometedores. La desregulación epigenética se ha identificado en muchas enfermedades pulmonares y probablemente impulsa la progresión y las manifestaciones de la sarcoidosis. Hemos demostrado previamente cambios en la expresión génica del ADNm y el ARNm en células de lavado broncoalveolar (BAL) de pacientes con enfermedad crónica por berilio (una enfermedad pulmonar granulomatosa causada por la exposición al berilio) y una pequeña muestra de pacientes con sarcoidosis (7, 8). Ningún otro estudio ha evaluado el ADNm en todo el epigenoma en la sarcoidosis, aunque otros han identificado microARN asociados con la enfermedad (9, 10). Además, los miRNA del BALF como miR-27b, miR-192 y miR-221 se han asociado con la progresión de la sarcoidosis pulmonar (11). Estos estudios estuvieron limitados por tamaños de muestra pequeños, enfoques específicos en lugar de enfoques que abarcaran todo el genoma y una falta de integración de diferentes modalidades ómicas.
Con un enfoque integrado más amplio que utilice varios tipos de datos genómicos, planteamos la hipótesis de que los estudios epigenómicos podrían vincular los factores de riesgo con la patobiología de la enfermedad para comprender mejor el curso de la enfermedad y subclasificar a los pacientes en función del perfil molecular; en última instancia, esto dirigiría la investigación enfocada en las manifestaciones y el tratamiento de la enfermedad. En un primer paso, realizamos este estudio para perfilar la expresión de DNAm, mRNA y miRNA en todo el genoma en células BAL de sarcoidosis, estratificadas por progresión de la enfermedad. Al analizar cada conjunto de datos por separado, identificamos muchas características moleculares asociadas con la enfermedad en general. A continuación, al construir un modelo multiómico disperso que incorpora DNAm, mRNA y miRNA, identificamos características asociadas con la sarcoidosis y la progresión pulmonar.
Métodos
Población de estudio
Las muestras de células BAL de sarcoidosis se obtuvieron del consorcio de Investigación Genómica en Deficiencia de Alfa-1 Antitripsina y Sarcoidosis (GRADS) (12) incluidos los casos de National Jewish Health (NJH, n = 17) y los casos de GRADS que no pertenecen a NJH (n = 39) y los casos del Biorepositorio de Granulomas de NJH (n = ocho). Los controles sin antecedentes de enfermedad pulmonar se obtuvieron del Centro de Donantes Pulmonares de NJH (n = 16). Todos los sujetos con sarcoidosis cumplieron con los criterios ATS/ERS (13) para la confirmación del diagnóstico de sarcoidosis mediante biopsia de tejido. En todos los casos de NJH, se revisaron los registros médicos para determinar las características clínicas, incluida la agudeza de la presentación (aguda/no aguda), la afectación de órganos, las pruebas de función pulmonar (PFT), las imágenes de tórax y el tratamiento inmunosupresor en el momento del BAL y hasta dos años después del BAL. En los casos de GRADS no NJH, la agudeza de la presentación, las PFT y el tratamiento inmunosupresor estaban disponibles en el momento y hasta seis meses después del BAL. Se excluyeron los casos con enfermedad radiográfica de tórax en estadio 4 fibrótico/Scadding y/o en tratamiento inmunosupresor en el momento del BAL.
Los casos de sarcoidosis se clasificaron como fenotipos pulmonares no progresivos o progresivos. El fenotipo no progresivo se definió como tener una presentación de enfermedad aguda (es decir, consistente con el síndrome de Lofgren) o no aguda, sin afectación de nuevos órganos, pruebas de función pulmonar con < 10% de disminución en FVC o FEV1, < 15% de disminución en DLCO e imágenes de tórax estables dentro de los dos años posteriores al BAL. El fenotipo progresivo tuvo una presentación de enfermedad no aguda; pruebas de función pulmonar con ≥ 10% de disminución en FVC o FEV1; o ≥ 15% de disminución en DLCO; empeoramiento de las imágenes de tórax; y/o requirió el inicio de un tratamiento inmunosupresor sistémico en cualquier momento hasta dos años después del BAL. Los casos GRADS no NJH se fenotiparon basándose únicamente en la agudeza de la enfermedad, PFT y estado de tratamiento.
Broncoscopia y procesamiento de ácidos nucleicos
La broncoscopia con BAL se realizó como se describió previamente (12, 14). Las células se aislaron y se congelaron a -80 C en tampón RLT. El ADN y el ARN se extrajeron utilizando el minikit de extracción de ADN/ARN AllPrep de Qiagen. El ADN genómico purificado se convirtió con bisulfito con el kit de conversión de bisulfito de metilación de ADN Zymo EZ-96, seguido de una amplificación de todo el genoma y fragmentación enzimática. El ADN se desnaturalizó y se hibridó con Illumina Infinium HumanMethylationEPIC BeadChips, seguido de una extensión de base única. Los BeadChips hibridados se tiñeron, lavaron y escanearon utilizando el sistema iScan de Illumina. Las bibliotecas de ARNm se prepararon a partir de 500 ng de ARN total con kits de preparación de bibliotecas de ARNm de cadena TruSeq (Illumina) y las bibliotecas de miARN se construyeron utilizando kits de preparación de bibliotecas de ARN-Seq pequeños de Lexogen. Las bibliotecas de ARN se secuenciaron a una profundidad promedio de 80 M de lecturas de extremos emparejados de 150 pb en Illumina NovaSeq 6000.
Análisis de datos
Los datos de secuenciación de ARN fueron producidos previamente en 28 muestras por el consorcio GRADS (6). Las lecturas de ARN de extremos emparejados de las muestras GRADS y NJH se alinearon a nivel genético con Ensembl GrCh38 usando STAR (15). La lectura directa de los archivos FASTQ de miRNA se alineó con las secuencias de miRBase v22.1 (16,17,18,19,20,21) utilizando miR-MaGiC (22). Se conservaron los miRNA presentes en al menos el 50 % de las muestras (n = 818). Los archivos de intensidad de señal idat de Illumina se procesaron utilizando SeSAMe; se realizó la normalización dentro de la muestra con sondas fuera de banda y la corrección del sesgo de colorante (23). Se eliminaron las sondas con mapeo no único e hibridación fuera del objetivo. Además, las sondas con un valor p de detección promedio ≥ 0,05 dentro de las muestras (lo que indica una incapacidad para discernir estadísticamente la señal del ruido de fondo) y las sondas de cromosomas sexuales se eliminaron antes del análisis. Los niveles de metilación se analizaron como valores M y se presentan en los resultados como valores β (24).
Para cada conjunto de datos, se ajustaron modelos lineales a cada característica para probar el efecto del diagnóstico de sarcoidosis o la enfermedad progresiva versus no progresiva, mientras se ajustaba por edad, sexo y estado de tabaquismo (utilizando el paquete R limma (25) para datos de metilación y DESeq2 (26) para los conjuntos de datos de ARN). Además, realizamos ajustes para tres componentes principales derivados de los datos en las comparaciones de casos y controles de metilación y ARNm. Los tamaños de efecto reducidos de las comparaciones de ARN (expresados como log2(fold change)) se calcularon utilizando la Estimación Posterior Aproximada para el GLM (apeglm) (27). Se derivaron distribuciones estadísticas de prueba nula para cada análisis utilizando Bacon para reducir el sesgo y la inflación (28). Los valores P se ajustaron a una tasa de falsos descubrimientos (FDR) del 5 % para tener en cuenta las pruebas múltiples realizadas mediante el procedimiento de Benjamini-Hochberg (29). Enriquecimiento de resultados significativos en el recurso Gene Ontology (GO) (30) y la Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas (KEGG) (31) se realizó utilizando GOmeth (32) para datos DNAm y clusterProfiler (33) para los datos de ARNm. Los CpG se anotaron en islas, plataformas y costas de CpG y elementos genéticos utilizando el paquete R annotatr (34). Los genes diana de miRNA confirmados experimentalmente se obtuvieron de MirTarBase (35). Para cada miRNA, conservamos los genes objetivo que tenían al menos 2…
