Resumen
Antecedentes
La displasia broncopulmonar (BPD) es una condición pulmonar crónica de neonatos prematuros, pero sin un tratamiento farmacológico establecido. El modelo de conejo BPD expuesto al 95% de oxígeno se ha utilizado en los últimos años para las pruebas de drogas. Sin embargo, la toxicidad del fuerte golpe hiperóxico impide un seguimiento a largo plazo debido a la alta mortalidad después de la primera semana de vida. Este estudio tuvo como objetivo extender el modelo de conejo prematuro al Día Postnatal (PND) 14 para imitar la fase en evolución de BPD y permitir la investigación de intervenciones terapéuticas en puntos de tiempo posteriores y más relevantes.
Métodos
Los cachorros de conejo prematuros entregados el día 28 de la gestación estuvieron expuestos al aire de la habitación o diferentes grados de hiperoxia (50% y 70% de O2) durante 14 días. Las administraciones de lipopolisacáridos intratraqueales (inmediatamente después del nacimiento) o doble (al nacer y en PND5) también se probaron en combinación con 50% de O2. Los conejos de edad emparejados entregados vaginalmente a término se usaron como controles. La supervivencia, el aumento de peso, la función pulmonar, el análisis Doppler de microultrasonido de la arteria pulmonar, la histología pulmonar (alveolarización, puntaje de lesiones pulmonares y estereología basada en el diseño) y imágenes de micro-CT longitudinales para comparar los resultados en PND14.
Resultados
El nacimiento prematuro en sí, sin ningún otro golpe de BPD, se asoció con déficit de la función pulmonar, desarrollo pulmonar retardado y anomalías cardiovasculares. El fenotipo pulmonar similar a BPD mejoró en un 70% de O2 pero no en una hiperoxia de O2 al 50%. Los LP intratraqueales administrados inmediatamente después del nacimiento se asociaron con puntajes de lesiones pulmonares significativamente más altas en PND14 y un aumento de la amortiguación del tejido, un marcador de resistencia al aire parenquimatoso.
Conclusión
Varias estrategias son factibles para extender el modelo de conejo prematuro de BPD a PND14. El parto prematuro en la fase sacular en sí, incluso en ausencia de otros hits de TLP postnatales, se asoció con déficit de la función pulmonar, desarrollo pulmonar retrasado y anomalías cardiovasculares en comparación con los cachorros de conejo a término de edad. Los fenotipos tipo BPD mejorados pueden lograrse aún más mediante la exposición continua a hiperoxia moderada (70% O2) y la administración intratraqueal de LPS.
Fondo
La displasia broncopulmonar (BPD) es una condición pulmonar crónica de neonatos prematuros con secuelas pulmonares a largo plazo (1, 2). El TLP ocurre casi exclusivamente en bebés extremadamente prematuros (es decir, nacidos por debajo de las 28 semanas de gestación) (3, 4) que muestran pulmones subdesarrollados y generalmente requieren apoyo respiratorio intensivo y oxígeno suplementario para adaptarse a la vida extrauterina (5). Aunque la ventilación mecánica prolongada y el oxígeno suplementario que le salen vidas inducen inflamación, lo que a su vez activa los mecanismos complejos de lesiones y reparaciones que finalmente conducen a la alveolarización y el desarrollo vascular arrestados (6). La inflamación perinatal también puede provenir de las infecciones prenatales (es decir, corioamnionitis) y postnatales, lo que aumenta aún más el riesgo de desarrollar BPD (7). Desafortunadamente, no hay cura para BPD, y la búsqueda de intervenciones farmacológicas sigue siendo una necesidad clínica insatisfecha.
Los modelos animales son cruciales para el desarrollo preclínico de los tratamientos farmacológicos. Roedores recién nacidos entregados a término y expuestos a hiperoxia postnatal (8,9,10,11) y otros insultos inflamatorios perinatales, como el lipopolisacárido prenatal (LPS)) (12,13,14), ya que los golpes de BPD experimentales se han utilizado ampliamente para la investigación exploratoria básica en el contexto de BPD. Sin embargo, los pulmones de roedores son completamente funcionales al nacer y, por lo tanto, no imitan la interrupción de gestación desencadenada por el parto prematuro (15). Los modelos animales grandes como los corderos prematuros, los lechones y los babuinos, que combinan el parto prematuro con otros golpes de BPD como la inflamación prenatal, la ventilación mecánica e hiperoxia, también se han utilizado en el desarrollo preclínico de la etapa tardía de los medicamentos BPD (p. Ej.16,17,18,19,20,21,22,23). Sin embargo, los modelos animales grandes son menos rentables y soportan preocupaciones éticas; Por lo tanto, son menos adecuados para la investigación exploratoria temprana sobre la terapéutica de TLP.
El modelo de conejo proporciona un buen compromiso entre los modelos BPD pequeños y grandes. Los conejos prematuros entregados a los 28 días de gestación (es decir, en la fase sacular temprana) muestran angustia respiratoria leve a moderada y desarrollo pulmonar postnatal deteriorado en el día postnatal (PND) 7 en comparación con los cachorros de conejo a término de edad.24). Por lo tanto, el parto prematuro solo puede considerarse como el primer éxito experimental de BPD. Se han utilizado conejos prematuros expuestos a un golpe hiperóxico adicional (95% de O2) durante siete días para las pruebas farmacológicas en el contexto de BPD (25,26,27,28); Sin embargo, este modelo tiene un seguimiento relativamente corto en comparación con modelos de roedores o corderos prematuros, que se pueden mantener durante varias semanas (29,30,31). Esta limitación se debe a la toxicidad fuerte e irreversible generada por la exposición al 95% de O2 de siete días en conejos prematuros, lo que reduce la vida útil de los cachorros (32) y limita la evaluación farmacológica de nuevos compuestos para encontrar una atenuación parcial del daño hiperóxico en PND7 (25, 27, 28). Un modelo de conejo prematuro a más largo plazo, hasta PND14, teóricamente permitiría intervenciones farmacológicas en puntos de tiempo posteriores y más relevantes, ofreciendo la posibilidad de tratar el curso temprano (fase inflamatoria) y en evolución (fase de remodelación) de BPD experimental. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo investigar la viabilidad de establecer un modelo BPD a largo plazo, aprovechar la característica de prematuridad de los conejos prematuros (es decir, la característica común única para todos los casos de BPD humanos) y combinándola con éxitos postnatales adicionales como la hiperoxia y la entrega intratraqueal de LP.
Materiales y métodos
Cuidado y parto de animales
Todos los procedimientos experimentales que involucraron animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal local (Cuerpo de Bienestar Animal: Organismo Preosto Al Benessere Animale (Italia), Número de archivo N ° 783/2019-PR) y cumplió con las regulaciones europeas estándar sobre investigación animal. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en Chiesi Farmaceutici, una instalación acreditada por Aaalac.
Se obtuvieron conejos blancos de Nueva Zelanda con tiempo de tiempo de Charles River Laboratories (Domaine des Oncins, Francia) y se mantuvieron a 15–21 ° C, humedad relativa de 55%± 15, 12:12 h ciclos de luz/oscuridad, y alimentos y agua ad libitum hasta que ocurrió la sección césaria (cesión c-sección) o nacimiento natural.
Los cachorros de conejos prematuros se entregaron a los 28 días de gestación (término 31 días). Para la cesárea, DoS (3.8 ± 0.3 kg) se sedó con medetomidina intramuscular (IM) 2 mg/kg (Domitor®, Orión Pharma, Finlandia). Diez minutos más tarde, recibieron 25 mg/kg de ketamina (IMalgene 1000®, Merial, Francia) y 5 mg/kg de xilazina (Rompun®, Bayer, Alemania) IM Posteriormente, se sacrificaron con una sobredosis de sodio pentotal (50 mg/kg, MSD Animal Health, USA). El abdomen se abrió inmediatamente, y el útero se expuso para extraer todas las cachorros a través de la histerectomía. Los cachorros se secaron, estimularon y se colocaron inmediatamente en incubadoras ad hoc (Okolab, Italia), donde la temperatura, el oxígeno y la humedad se establecieron de acuerdo con la condición experimental de cada grupo. Se colocaron conejos prematuros en ropa de cama blanda esterilizada y permanecieron en la incubadora, excepto la alimentación. El material de la vivienda se cambió diariamente. Los cachorros se alimentaron dos veces al día (mañana y tarde) a través de un tubo de 3.5 FR (Vygon, Francia) con un reemplazo de leche (Día One®, proteína 30%, grasa 50%; Foxvalley, EE. UU.) Se disuelto en agua (250 mg/ml). Los probióticos (25 mg/ml, Bio-LAPIS®; ProbioTics International Ltd, Reino Unido) se agregaron diariamente, mientras que las inmunoglobulinas adicionales (15 mg/ml, Col-O-CAT®, Sanobest, Países Bajos) solo se administraron en los primeros dos días. El volumen de alimentos aumentó progresivamente de 80 ml/kg/día el día de nacimiento a 100 ml/kg/día en PND1, 150 ml/kg/día en PND2 y 200 ml/kg/día desde PND3 hasta el final del período experimental (PND14). El volumen total se dividió en dos alimentos diarios. El día 2, la vitamina K se administró por vía intramuscular (0.25 mg/kg, Konakion®; Roche). Los cachorros fueron estimulados para orinar dos veces al día antes de alimentarse. De PND7 a PND14, los cachorros se dejaron orinar antes de que su peso se midiera por la mañana.
Los cachorros a término fueron entregados y fomentados vaginalmente por sus madres. Se colocaron en jaulas especiales equipadas con una caja externa donde podían construir su nido.
Grupos experimentales
Los cachorros de conejos de sesiones experimentales independientes realizadas entre noviembre de 2019 y abril de 2021 se asignaron a uno de los seis grupos experimentales (Fig. 1). El nacimiento prematuro se consideró como el primer golpe de BPD, y la inflamación mediada por hiperoxia y LPS se añadió en grupos experimentales seleccionados como golpes de BPD segundo y tercer.
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1)
Los cachorros a término de edad se entregaron naturalmente y se mantuvieron bajo normoxia durante 11 días (Término grupo, n = 24).
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2)
Cachorros prematuros mantenidos bajo normoxia durante 14 días (Nox grupo, n = 90).
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3)
Pups prematuros mantenidos bajo hiperoxia (Hox) 50% O2 durante 14 días (Hox-50% grupo, n = 65).
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4)
Preterm pups kept under Hox 50% O2 for 14 days that received an intratracheal injection of LPS (Escherichia coli 0111: B4, 5 mg/kg) dissolved in 100 mg/kg of Poractant alfa (Curosurf, Chiesi Farmaceutici, Italy) one hour after birth, using the intratracheal surfactant administration protocol previously described (33) (Hox-50% + X1LPS grupo, n = 44).
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