El ARN largo no codificante HOTAIR facilita la apoptosis de las células endoteliales vasculares pulmonares a través de la hipermetilación mediada por DNMT1 del promotor Bcl-2 en la EPOC

Abstracto

Antecedentes

Estudiar el efecto regulador del ARN antisentido del transcrito HOX de ARN no codificante largo (LncRNA) (HOTAIR) sobre la apoptosis de las células endoteliales vasculares pulmonares (HPVEC) y determinar si HOTAIR facilita la apoptosis de HPVEC a través de la hipermetilación mediada por DNMT1 del promotor Bcl-2 en pacientes obstructivos crónicos. enfermedad pulmonar (EPOC).

Métodos

La matriz LncRNA se utilizó para medir los lncRNA expresados ​​diferencialmente en tejidos pulmonares con EPOC y sin EPOC. La expresión de HOTAIR en pulmones de pacientes con EPOC y HPVEC inducido por extracto de humo de cigarrillo (CSE) se evaluó mediante qRT-PCR. La ubicación de HOTAIR se determinó en pulmones de pacientes con EPOC y HPVEC mediante hibridación in situ de ARN (RNA-ISH). El modelo de ratón con enfisema y los ratones knockdown HOTAIR se establecieron cada uno inhalando humo de cigarrillo o instilando vectores lentivirales intratraqueales. La desregulación de la enzima ADN metiltransferasa 1 (DNMT1), el linfoma de células B-2 (Bcl-2), la proteína X asociada a Bcl-2 (Bax) y la expresión de la proteína caspasa 3 escindida se detectaron mediante transferencia de Western. La expresión de ARNm de HOTAIR, DNMT1, Bcl-2 y Bax se midió mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real. Se usaron ensayos TUNEL (etiquetado del extremo de la muesca del dUTP de la desoxinucleotidil transferasa terminal) para evaluar la tasa de apoptosis en ratones y HPVEC inducido por CSE. Se realizó un ensayo de PCR específico de metilación (MSP) para observar las alteraciones en la metilación del promotor Bcl-2 en las muestras. Se utilizó el ensayo desplegable de ARN para el análisis de la correlación entre HOTAIR y DNMT1.

Resultados

Los niveles de expresión de HOTAIR aumentaron en los pulmones de pacientes con EPOC y HPVEC inducido por CSE. Se encontró apoptosis de HPVEC con expresión de Bcl-2 regulada a la baja, aumento de la metilación del promotor, DNMT1, Bax y expresión de Cleaved-caspasa 3 en el modelo de ratón con enfisema y HPVEC inducido por CSE. Knockdown HOTAIR puede atenuar la apoptosis celular y el enfisema a través de la hipermetilación mediada por DNMT1 del promotor Bcl-2 en ratones. In vitro, HOTAIR puede agravar la apoptosis de HPVEC expuestos a CSE. DNMT1 era un objetivo de HOTAIR y tenía una correlación positiva con HOTAIR.

Conclusión

HOTAIR facilita la apoptosis de HPVEC a través de la hipermetilación mediada por DNMT1 del promotor Bcl-2 en la EPOC, y atenuar la expresión de HOTAIR puede ser una nueva terapia para prevenir la EPOC.

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es un desafío de salud pública mundial debido a su alta prevalencia y mortalidad relacionada [1, 2]. El estudio China Pulmonary Health (CPH) informó que la prevalencia general de la EPOC definida por espirometría fue del 8,6% entre la población general china de 20 años o más y el número total estimado de personas fue de 99,9 millones. [3]. Fumar cigarrillos es un factor de riesgo bien conocido para la EPOC y nuestra investigación anterior encontró que fumar cigarrillos participa en la progresión de la enfermedad a través de la apoptosis endotelial [4,5,6,7,8,9,10,11]. La desregulación de la enzima ADN metiltransferasa 1 (DNMT1) se considera la metiltransferasa primaria, que contribuye a la metilación de novo y al mantenimiento del ADN. [12]. El linfoma-2 de células B (Bcl-2) y la proteína X asociada a la proteína proapoptótica Bcl2 (Bax) determinan conjuntamente si la mitocondria liberará citocromo C (cito C), que es el factor inicial de la apoptosis [13]. Nuestro estudio adicional encontró que la inhibición de la metilación del ADN puede aliviar la apoptosis endotelial inducida por el extracto de humo de cigarrillo (inducida por CSE) y la metilación del promotor Bcl-2. La metilación del promotor Bcl-2 podría estar involucrada en la apoptosis endotelial inducida por CES [11, 14]. Sin embargo, los mecanismos subyacentes que median en el proceso de apoptosis siguen siendo en gran parte desconocidos.

Los ARN largos no codificantes (LncRNA) se definen funcionalmente como transcritos de más de 200 nucleótidos de longitud que no tienen potencial de codificación de proteínas. [15]. Cada vez se reconoce más que los LncRNA participan en muchos procesos biológicos a través de diversos mecanismos, como la modificación de la cromatina, la regulación de la actividad de las proteínas, la impresión de genes, etc. [16]. El ARN antisentido de la transcripción de HOX (HOTAIR) es el primer lncRNA que tiene un efecto de acción trans. Puede regular positiva o negativamente la proliferación celular, la apoptosis, la invasión y otros procesos vitales al unirse a la región promotora de los genes aguas abajo. [17,18,19].

Los hallazgos de Guo Liu identificaron un papel esencial de HOTAIR en la promoción de la apoptosis inducida por ultravioleta y la lesión inflamatoria al regular al alza la PKR en los queratinocitos[[17]. Otro estudio mostró que HOTAIR silenciado redujo las expresiones de proteína DNMT1 en células de cáncer de próstata [18]. Sin embargo, aún no está claro si HOTAIR tiene un papel en el progreso de la EPOC mediante la regulación de la función de las células endoteliales vasculares pulmonares.

Sobre la base de los estudios anteriores, postulamos que HOTAIR facilita la apoptosis de las células endoteliales vasculares pulmonares a través de la hipermetilación mediada por DNMT1 del promotor Bcl-2 en la EPOC.

Métodos

Muestras de tejido pulmonar

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética y Ensayos Clínicos del Segundo Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur y se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado. El número de protocolo CE es: No. ChiCTR-POC-2017126. Se incluyeron 13 sujetos: no fumadores (n = 4) y fumadores con EPOC (n = 5) y sin EPOC (n = 4). Se obtuvieron muestras de tejido pulmonar periférico de sujetos que se sometieron a resección por nódulo pulmonar solitario o cáncer de pulmón en el Segundo Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur. Las muestras de tejido se resecaron a una distancia mínima de 5 cm del lugar de la lesión. El diagnóstico de EPOC se basó en la Iniciativa Global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (GOLD) 2017 [1]. Los pacientes con EPOC presentaban limitación al flujo aéreo (volumen espiratorio forzado en 1 s/capacidad vital forzada[FEV1/FVC]<0,7). Todos los pacientes se encontraban en un estado clínicamente estable sin infección pulmonar en las últimas 4 semanas. Los fumadores se definieron como sujetos que tenían un historial de al menos 20 paquetes-año de consumo de cigarrillos. [2]. Las muestras de tejido pulmonar se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para realizar más experimentos, o se fijaron en formaldehído al 4 % y se cortaron en secciones de 3,5 mm de espesor para la inmunotinción y la tinción TUNEL.

animales

Este protocolo animal fue aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur. Nuestro experimento dividió a los ratones (C57BL/6J, 6 semanas de edad, macho) en cinco grupos (n = 5 en cada grupo). El grupo de control estuvo expuesto al aire normal desde las 8 a las 16 semanas de edad, y el grupo CS estuvo expuesto a CS cuatro veces al día durante el mismo período. [10, 11]. El grupo CS también fue tratado con lenti-vacío (108 pfu por ratón, una vez a la semana, por vía intratraqueal) a las 6 y 7 semanas de edad, y luego expuesto a CS de 8 a 20 semanas de edad. A los dos últimos grupos se les administró shRNA lenti-HOTAIR (108 pfu por ratón, una vez a la semana, por vía intratraqueal) a las 6 y 7 semanas de edad, o lenti-HOTAIR shRNA más Lenti-DNMT1 Expressing Vector (108 pfu por ratón, una vez a la semana, por vía intratraqueal) a las 7 semanas de edad [9]. Todos los grupos se etiquetaron como control, CSE, CSE + Si-HOTAIR, CSE + Vector y CSE + Si-HOTAIR + OE-DNMT1. Un ratón CSE + Si-HOTAIR murió durante el experimento y dos ratones CSE + Si-HOTAIR + OE-DNMT1 murieron durante el experimento. De acuerdo con las muestras humanas, los tejidos del pulmón izquierdo de los ratones se inflaron con formalina al 10 % a una presión constante de 25 cm H2O durante 24 h y posteriormente fijado e incrustado. La proteína se extrajo siguiendo el mismo protocolo que el utilizado para las muestras humanas.

Líneas celulares y cultivo.

Se compraron células endoteliales vasculares pulmonares humanas (HPVEC, por sus siglas en inglés) de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China) y se cultivaron en DMEM (Hyclone, Logan, UT, EE. Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) a 37 °C en un 5 % de CO2 cámara de cultivo. La inanición durante 24 h se realizó antes de…

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