Resumen
Investigamos los cambios a largo plazo en las propiedades morfológicas y contráctiles del músculo gastrocnemio en un modelo de desgarro del ligamento cruzado anterior (LCA) de rata. Los animales de experimentación fueron ratas Wistar macho de 8 semanas de edad en las que se seccionó el LCA derecho. El músculo gastrocnemio en la extremidad afectada y el mismo músculo en la extremidad contralateral se extrajeron 4 y 48 semanas después de la sección del LCA. Creamos secciones congeladas en serie de los tejidos y realizamos tinciones inmunohistoquímicas. En resultados, a las 4 semanas, la relación entre el peso húmedo del músculo y el peso corporal y el área de sección transversal (CSA) de la fibra muscular tipo I y IIb en la porción profunda del músculo fueron significativamente menores en el lado afectado por la sección transversal. que en el lado contralateral (p
Palabras clave: LCA; músculo gastrocnemio; Fibra muscular; Rehabilitación; Lesion deportiva
Introducción
Un desgarro del ligamento cruzado anterior (LCA) es una lesión traumática que ocurre con frecuencia durante las actividades deportivas. El LCA restringe la estabilidad de la articulación de la rodilla, y un LCA desgarrado da como resultado una laxitud anterior excesiva de la tibia en relación con el fémur y la inestabilidad rotacional de la extremidad inferior, lo que plantea obstáculos importantes para el rendimiento deportivo. Por lo tanto, la reconstrucción del LCA generalmente se realiza para atletas con tal lesión. [1-3]. Cuando la lesión del LCA se produce en personas no deportistas o de edad avanzada que no practican actividades deportivas, generalmente se realiza un tratamiento conservador centrado en mejorar la fuerza muscular. [4-6].
El entrenamiento de fuerza muscular y la evaluación clínica detallada a intervalos regulares son extremadamente importantes durante el período de rehabilitación, ya sea después de una cirugía o en un tratamiento conservador. Los músculos más comúnmente utilizados para este propósito son los cuádriceps en la parte delantera del muslo y los isquiotibiales en la parte posterior. Ambos músculos particulares cruzan la articulación de la rodilla. [7]y algunos informes han indicado que la inestabilidad de la articulación de la rodilla causada por un desgarro del LCA produce cambios en la morfología muscular y las propiedades contráctiles [8]. De los músculos periarticulares de la rodilla, el gastrocnemio es el que más afecta la función de las extremidades inferiores. Este músculo tiene la función de flexión plantar en el tobillo y flexión en la articulación de la rodilla. El músculo gastrocnemio tiene dos cabezas (medial y lateral) y, al igual que el cuádriceps y los isquiotibiales, cruza la articulación de la rodilla. Por lo tanto, creemos que un desgarro del LCA tiene algún efecto sobre el gastrocnemio. [8]. Sin embargo, parece faltar investigación fisiológica básica centrada en el músculo gastrocnemio después de una lesión del LCA.
Por otro lado, clínicamente, el período de observación después de la reconstrucción del LCA suele durar unos años. [9,10]. Sin embargo, cuando la lesión se trata de forma conservadora, la inestabilidad de la articulación de la rodilla puede persistir indefinidamente, por lo que creemos que es importante un seguimiento prolongado a intervalos de algunas décadas. Ha habido algunos estudios previos sobre este asunto. [5,11,12]pero los efectos de un desgarro del LCA a lo largo de la vida del paciente siguen siendo en gran parte desconocidos.
El propósito de este estudio fue investigar los cambios morfológicos y contráctiles (peso húmedo, área de sección transversal y composición del tipo de fibra) del músculo gastrocnemio en ratas a las 4 y 48 semanas después de la sección del LCA. Presumimos que una transección del LCA produce cambios en las propiedades morfológicas y contráctiles del músculo gastrocnemio y que estos cambios persisten durante mucho tiempo.
Métodos
Animales y Agrupación
El estudio se realizó de acuerdo con las Directrices para experimentos con animales de la Facultad de medicina de la Universidad de St. Marianna y fue aprobado por el Comité de experimentos con animales de laboratorio de la Facultad de medicina de la Universidad de St. Marianna (Número de aprobación: 1502019).
Para el estudio se utilizaron doce ratas Wistar macho de 8 semanas de edad. Todos se mantuvieron en un criadero bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas/12 horas a temperatura ambiente constante (24 ± 1 °C) y humedad (55 ± 10 %) y se les permitió libre acceso a comida y agua.
Todos fueron sometidos a dos procedimientos quirúrgicos: transección del LCA derecho y una operación simulada en la pata trasera izquierda. Los músculos gastrocnemios se asignaron como grupos de ACL transeccionado (A) (n=12) y control contralateral (C) (n=12), respectivamente.
Procedimientos Quirúrgicos y Recolección y Preparación de Músculo
Para simular un desgarro del LCA, se seccionó el LCA del miembro trasero derecho de cada rata. Las ratas se colocaron bajo anestesia general profunda inducida con isoflurano (Forane®, Abbott Japan, Tokio). La piel que cubre la región anteromedial de la articulación de la rodilla del miembro posterior derecho se incidió longitudinalmente y la rótula se invirtió lateralmente, exponiendo la articulación. Con la rodilla en flexión profunda y el uso de un bisturí, la sección del LCA se realizó bajo visión directa. La inestabilidad anterior de la tibia y la inestabilidad rotacional del fémur se confirmaron manualmente, y luego se suturó la cápsula articular y la piel. Una operación simulada realizada en la extremidad trasera izquierda. Con las ratas aún bajo anestesia profunda, se expuso la articulación de la rodilla trasera izquierda como se describe anteriormente, y se suturaron la cápsula articular y la piel sin que se hubiera realizado la sección del LCA.
Los músculos gastrocnemios derecho e izquierdo se extrajeron de seis ratas a las 4 semanas y de las seis ratas restantes a las 48 semanas. El peso húmedo del músculo se midió en el momento de la recolección y se registró como la relación entre el peso húmedo del músculo y el peso corporal. A continuación, los tejidos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.
Análisis inmunohistoquímico
Las muestras obtenidas a las 4 y 48 semanas se sometieron a análisis inmunohistoquímicos. El vientre de la cabeza medial del músculo gastrocnemio congelado se cortó en serie en secciones horizontales de 12 μm de espesor con un criostato (CM 1900, Leica, Wetzlar, Alemania).
La inmunotinción se realizó de la siguiente manera: las secciones congeladas se calentaron a 36 °C durante 30 minutos, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se cubrieron y sumergieron en tampón de bloqueo (Blocking One Histo, Nacalai Tesque, Kioto, Japón). Las muestras se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos, se eliminó el tampón de bloqueo y las muestras se lavaron dos veces durante 2 minutos con PBS. Los siguientes anticuerpos primarios se añadieron a un tampón de bloqueo que se diluyó 20 veces con PBS + Tween 20 al 0,1 % (PBST), y las secciones de tejido se hicieron reaccionar durante 1 día a 4 °C con cadena pesada de miosina anti-tipo I (MyHC ) isoforma (MyHCI, 1:100, BA-F8; Developmental Studies Hybridoma Bank [DSHB], Ciudad de Iowa, Iowa, EE. UU.); isoforma MyHC anti-tipo IIa (MyHCIIa, 1:100, SC-71, DSHB); isoforma MyHC anti-tipo IIb (MyHCIIb, 1:100, BF-F3, DSHB); y antilaminina (Z0097; diluido 1:500; Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca).
A continuación, las secciones se lavaron con PBS y se sumergieron en los siguientes anticuerpos secundarios: IgG2b anti-ratón de cabra marcado con Alexa Flour 488 (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.); IgM anti-ratón de cabra marcado con Alexa Flour 568 (1:1000, Invitrogen); IgG1 anti-ratón de cabra marcado con Alexa Fluor 350 (1:200, Invitrogen); y Alexa Flour 488 F (ab’) 2 fragmento de cabra anti-conejo IgG (H+L) (1:2000, Invitrogen). Las secciones se hicieron reaccionar durante 1 hora en un cuarto oscuro a temperatura ambiente, luego se lavaron en PBS, se cubrieron con cubreobjetos de vidrio y se criopreservaron.
El análisis histoquímico de las muestras teñidas se realizó bajo un microscopio óptico (KEYENCE Japón, Osaka, Japón). Las porciones superficial y profunda del gastrocnemio se extrajeron al azar de uno de dos campos visuales, como lo describen Armstrong y Phelps. [13]. Usando la Imagen J (Ver.1.51, Wayne Rasband, Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.) para el análisis, contamos de 300 a 400 fibras musculares por campo visual y luego clasificamos las fibras musculares por tipo (Tipo I, IIa, IIx o IIb) (Figura 1) en las porciones superficial y profunda y registró el porcentaje de cada tipo. El área transversal de la fibra muscular (CSA) también se midió para cada tipo de fibra muscular. [8,14].
Tipo de fibra muscular (Tipo I, IIa, IIx y IIb)…
