Disbiosis inducida por humo de cigarrillo: análisis comparativo de los microbiomas pulmonares e intestinales en ratones y pacientes con EPOC

Resumen

Antecedentes

El impacto del humo del cigarrillo (SC) en las enfermedades pulmonares y el papel de la disbiosis del microbioma en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se han informado anteriormente; sin embargo, las relaciones siguen sin estar claras.

Métodos

Nuestra investigación examinó los efectos de la exposición al humo de cigarrillo (CS) durante 20 semanas en los microbiomas pulmonar e intestinal de ratones C57BL/6JNarl, junto con una comparación con datos del microbioma intestinal de pacientes con EPOC de un conjunto de datos públicos.

Resultados

El estudio encontró que la exposición al CS disminuyó significativamente la capacidad vital forzada (FVC), engrosó las paredes de las vías respiratorias e indujo enfisema. Se observó un aumento del daño pulmonar junto con mayores niveles de quimioatrayentes de queratinocitos pulmonares (KC) por la exposición al CS. El análisis del microbioma pulmonar reveló un aumento de Actinobacteriota, mientras que el microbioma intestinal mostró cambios significativos en la diversidad, lo que indica disbiosis. El análisis de coordenadas principales destacó composiciones distintas del microbioma intestinal entre los grupos de control y expuestos al CS. En el microbioma intestinal, se observaron disminuciones notables en Patescibacteria, Campilobacterota, Defferibacterota, Actinobacteriota y Desulfobacterota. También identificamos correlaciones entre la función pulmonar y la disbiosis en los microbiomas pulmonar e intestinal. Los niveles de interleucinas pulmonares, interferón-ɣ, KC y 8-isoprostano se relacionaron con la disbiosis del microbioma pulmonar. Cabe destacar que los patrones de disbiosis en ratones expuestos al CS fueron similares a los de los pacientes con EPOC, en particular de los pacientes en estadio 4 de la Iniciativa Global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (GOLD). Esto sugiere un impacto sistémico de la exposición al CS.

Conclusión

En resumen, la exposición al CS induce una disbiosis significativa en los microbiomas pulmonar e intestinal, que se correlaciona con el deterioro de la función pulmonar y las lesiones. Estos resultados coinciden con los cambios en los pacientes con EPOC, lo que subraya el importante papel del microbioma en las enfermedades pulmonares relacionadas con el humo.

Introducción

El humo del cigarrillo (SC) es una de las principales causas de muertes evitables en todo el mundo (1). Si bien la prevalencia del tabaquismo está disminuyendo en los países desarrollados, sigue aumentando en muchos países en desarrollo, en particular en Asia (2). Aproximadamente la mitad de los fumadores desarrollarán enfermedades graves relacionadas con el tabaquismo, incluidas la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la enfermedad cardiovascular y varios tipos de cáncer.1, 3). En enfermedades pulmonares como la EPOC, la inflamación crónica de las vías respiratorias es un patomecanismo clave, a menudo atribuido a la inflamación aguda persistente causada por la inhalación de CS (1). A pesar de los numerosos estudios que informan sobre el impacto del CS en las enfermedades pulmonares, los mecanismos por los cuales el CS modula los cambios que resultan en enfermedades pulmonares siguen sin estar claros.

El microbioma pulmonar, que abarca la microbiota viable y no viable que reside en los tejidos parenquimatosos, desempeña un papel importante en la preservación de la salud pulmonar y puede alterarse en enfermedades pulmonares.4, 5). Por ejemplo, un estudio previo que involucró a sujetos con EPOC reveló que la disbiosis del microbioma pulmonar está asociada con la gravedad de la EPOC, las exacerbaciones y los resultados clínicos adversos (6). Esta disbiosis, caracterizada por el crecimiento de bacterias patógenas, también está relacionada con el deterioro del sistema inmunológico observado en la EPOC (7). Además, un desequilibrio en el microbioma pulmonar se ha asociado con inflamación, cambios patológicos en las vías respiratorias, reacciones inmunes y empeoramiento de los síntomas clínicos en la EPOC (8,9,10). Además, tanto el tabaquismo activo como la exposición al humo de segunda mano se asocian con la presencia de bacterias potencialmente patógenas (11). Otro estudio demostró que la exposición al CS en ratones durante 72 días altera la homeostasis del microbioma intestinal y promueve la inflamación sistémica (12). Si se considera que el tabaquismo es un factor de riesgo importante para el desarrollo de EPOC, esto sugiere que la exposición al CS puede provocar disbiosis del microbioma y contribuir potencialmente al desarrollo de EPOC. No obstante, las alteraciones en los microbiomas pulmonar e intestinal ejercen efectos negativos sustanciales sobre la salud humana.

Los vínculos exactos entre los microbiomas pulmonar e intestinal, la función pulmonar y las lesiones debidas a la EPOC inducida por CS siguen sin estar claros. El objetivo de este estudio fue explorar cómo la exposición al CS afecta la función pulmonar, los cambios fenotípicos pulmonares y los microbiomas pulmonar e intestinal en ratones, estableciendo paralelismos con la EPOC.

Materiales y métodos

Animales

Se obtuvieron ratones machos C57BL/6JNarl de seis semanas de edad del Centro Nacional de Animales de Laboratorio en Taipei, Taiwán. Se los alojó en un entorno controlado con una temperatura constante de 22 ± 2 °C, una humedad relativa (HR) del 55 % ± 10 % y un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 horas. Todos los experimentos con animales se ajustaron a las normas establecidas por el comité de revisión ética y de animales del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Taipei (Taipei, Taiwán; IACUC: LAC-2021-0260).

Modelo de enfisema inducido por CS

Cifra S1 En la Información complementaria (IE) se muestra el diseño experimental esquemático del estudio. Los ratones estuvieron expuestos constantemente a CS utilizando un sistema de generación de CS equipado con un sistema de exposición de cuerpo entero (grupo CS). Al mismo tiempo, un grupo de control de ratones estuvo expuesto a aire filtrado con partículas de alta eficiencia (HEPA) sin humo de cigarrillo. El sistema de generación de CS y el sistema de exposición de cuerpo entero (TECNIPLAST, Italia) se han informado previamente (13). Los ratones del grupo CS estuvieron expuestos al CS durante 20 semanas (4 cigarrillos/hora, 8 h/día y 5 días/semana) (14), mientras que los ratones del grupo de control estuvieron expuestos a aire libre de CS durante 20 semanas simultáneamente. En la semana 21, se recogieron muestras fecales en condiciones estériles y se realizaron pruebas de función pulmonar seguidas de necropsia Zoletil 50 (Virbac; Taipei, Taiwán) (0,1 ml/ratón) y Rompun 2% (Bayer Korea, Ltd.; Ansan, Gyeonggi-do, Corea) (0,05 ml/ratón) mediante inyección intraperitoneal antes de la recolección de suero, líquido de lavado broncoalveolar (BALF), muestras de pulmón e intestino en condiciones estériles como se describió previamente (13). Brevemente, la recolección de sangre se realizó a través del método submandibular. Después de la recolección, las muestras de sangre se mantuvieron a temperatura ambiente durante una hora antes de centrifugarse a 200 G a 4 °C durante 10 min. El suero resultante se separó y se almacenó a -80 ºC. El líquido cefalorraquídeo basal se obtuvo enjuagando los pulmones tres veces con 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril. Las muestras de líquido cefalorraquídeo basal se sometieron a centrifugación a 200 G durante 10 min a 4 °C, y el sobrenadante resultante se recolectó y se almacenó a -80 ºC para uso futuro. El sistema de exposición se detalla con más detalle en la Sección S1 en SI.

Medición de la función pulmonar

La función pulmonar se midió con Flexivent (SCIREQ; Sterling, VA, EE. UU.). La calibración se realizó antes del experimento de acuerdo con el manual del fabricante. Se insertó a los ratones un catéter blando de calibre 24 y se los conectó al respirador en Flexivent con una concentración de isoflurano del 2 al 3 %. En este estudio se midieron el volumen espiratorio forzado a los 0,1 s (FEV0,1), la capacidad vital forzada (FVC), el flujo espiratorio máximo (PEF), la relación FEV0,1/FVC, la capacidad inspiratoria, la resistencia de las vías respiratorias y la amortiguación tisular.

Grosor de la pared de las vías respiratorias y intersección lineal media (MLI)

Las muestras de pulmón se inflaron con formalina tamponada neutra al 10 % mediante instilación intratraqueal a una presión de 25 cmH2O durante 10 min. Luego, los tejidos pulmonares se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones para teñirlos con hematoxilina y eosina (H&E). Las imágenes de H&E pulmonares se obtuvieron mediante el software Motic Easyscan Pro y Motic DSAssistant (Motic, Xiamen, Fujian, China). El grosor de la pared de las vías respiratorias se evaluó mediante el uso del software ImageJ (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.) basado en imágenes capturadas con un aumento de 20x. El MLI evaluó la longitud de las líneas cruzadas y el número de intersecciones de líneas de cuadrícula en el espacio alveolar de 10 campos no superpuestos de cada muestra de pulmón de acuerdo con el método descrito anteriormente (Crowley et al., 2019).

Evaluación del daño pulmonar

La evaluación del daño pulmonar se realizó utilizando el algoritmo de agrupamiento K-means con el software ImageJ. Este algoritmo ordenó y clasificó los puntos en los portaobjetos de H&E según la intensidad y densidad de tinción, lo que indica la gravedad variable de la lesión (15, dieciséis). Todos los píxeles de las imágenes de tejido se clasificaron en cuatro grupos, incluido un componente de fondo y tres grupos altamente correlacionados con regiones lesionadas. Para evitar un posible sesgo en la agrupación relativa de tejido lesionado de manera heterogénea, cada imagen de un solo lóbulo se definió como una referencia de comparación y se agruparon. Se identificaron zonas graves, caracterizadas por un daño máximo (rojo), zonas leves con remodelación morfológica activa (verde) y zonas normales que muestran apariencias homeostáticas (azul).

Puntuación de inflamación intestinal

Los intestinos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % y se incluyeron en parafina. Luego, las secciones de tejido intestinal se tiñeron con H&E mediante métodos de rutina. La puntuación de inflamación en las secciones distales del colon se calificó de 0 (mínima) a 4 (inflamación marcada) de acuerdo con un esquema de puntuación de una publicación anterior (17).

Extracción de proteínas de tejido pulmonar e intestinal.

La extracción de proteínas en tejido pulmonar e intestinal se realizó homogeneizando los tejidos en un tampón que contenía reactivo de lisis celular CelLytic MT (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.), 1 % de inhibidor de proteasa y 1 % de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) moliendo la muestra. Las muestras se centrifugaron a 16 000 g en una centrífuga a 4 ºC durante 30 min. Luego se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -80 °C para su uso posterior.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Se realizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para evaluar los niveles de interleucina (IL)-1β, IL-10, IL-17 A, interferón (IFN)-ɣ, quimiocina (motivo CXC) ligando 1/quimioatrayente de queratinocitos (CXCL1/KC) (R&D Systems, MN, EE. UU.) y 8-isoprostano (Cayman Chemicals, MI, EE. UU.) en líquido cefalorraquídeo blanqueado, suero, pulmón e intestino de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó el kit de reactivos de ensayo de proteínas BCA (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) para determinar…

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