Resumen
Antecedentes
La infección y la colonización microbiana se asocian frecuentemente con la progresión de la enfermedad y malos resultados clínicos en la bronquiectasia. La identificación del espectro de patógenos es crucial para el tratamiento de precisión en la exacerbación de la bronquiectasia.
Métodos
Realizamos un estudio de cohorte prospectivo en pacientes con inicio de exacerbación de bronquiectasias y estado estable. Se recogió líquido de lavado broncoalveolar (BALF) para pruebas microbiológicas convencionales (CMT) y secuenciación metagenómica de próxima generación (mNGS). Se monitoreó a los pacientes con bronquiectasias para documentar el tiempo hasta la siguiente exacerbación durante el seguimiento longitudinal.
Resultados
Reclutamos a 168 participantes elegibles en las cohortes de exacerbación y 38 pacientes con bronquiectasias en estado estable en el seguimiento longitudinal. 141 pacientes con bronquiectasias al inicio de la exacerbación tenían patógenos definitivos o probables mediante la combinación de CMT con informes mNGS. Identificamos que Pseudomonas aeruginosa, micobacterias no tuberculosas, Haemophilus influenzae, Nocardia spp. y Staphylococcus aureus fueron los 5 patógenos principales con una tasa de detección más alta en nuestras cohortes mediante la combinación de CMT y análisis mNGS. También observamos fuertes correlaciones de Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, micobacterias no tuberculosas con la gravedad de la enfermedad, incluida la duración de la enfermedad, el índice de gravedad de la bronquiectasia y la función pulmonar. Además, el índice patogénico ajustado del microorganismo patógeno potencial se correlacionó negativamente (r = -0,7280, p < 0,001) con el tiempo hasta la siguiente exacerbación de la bronquiectasia.
Conclusión
Hemos revelado el espectro microbiano patógeno en las vías respiratorias inferiores y la correlación negativa de la colonización por PPM con el tiempo hasta la siguiente exacerbación en la bronquiectasia. Estos resultados sugieren que los patógenos contribuyen a la progresión de la bronquiectasia.
Introducción
La bronquiectasia es una enfermedad crónica de las vías respiratorias que se caracteriza por la dilatación progresiva e irreversible de los bronquios debido al daño recurrente de la pared bronquial (1). Las presentaciones clínicas de la bronquiectasia incluyen tos crónica, flema purulenta, hemoptisis e infección pulmonar repetida (2, 3). Sin embargo, la patogenia de la bronquiectasia sigue siendo esquiva. La hipótesis del “vórtice vicioso” sugiere que los cambios en el microambiente de las vías respiratorias (como la alteración de la depuración mucociliar) facilitan la colonización de microorganismos y aumentan el riesgo futuro de infección (4, 5). La incapacidad de eliminar los patógenos podría, a su vez, inducir una inflamación neutrofílica de las vías respiratorias y la progresión a la destrucción de las vías respiratorias (4, 5).
Las infecciones recurrentes desempeñan un papel central en la patogenia de la bronquiectasia. Estudios previos han demostrado que los pacientes con bronquiectasias e infección por Pseudomonas aeruginosa presentaban síntomas clínicos más graves, mayor frecuencia de exacerbaciones, mayor gravedad de la enfermedad y peor función pulmonar (6). Aunque son eficaces entre los pacientes con bronquiectasias, los antibióticos no pueden erradicar fácilmente una serie de microorganismos patógenos potenciales (MPP). Además, el estado de colonización y las mayores cargas bacterianas de los MPP se han relacionado con peores resultados clínicos y peor respuesta a los antibióticos en pacientes con bronquiectasias y EPOC (7, 8).
En vista del papel fundamental de la infección en la progresión de la bronquiectasia, es crucial identificar los MPP y evaluar su abundancia en las vías respiratorias inferiores. Estos pasos son esenciales para obtener información sobre la fisiopatología de la bronquiectasia y para orientar el tratamiento antibiótico al inicio de las exacerbaciones. El uso oportuno y apropiado de antibióticos es fundamental para prevenir el deterioro de la función pulmonar y la progresión a la exacerbación de la bronquiectasia (9). En principio, la secuenciación metagenómica de próxima generación (mNGS) puede detectar microorganismos de cualquier secuencia genómica conocida y se ha utilizado ampliamente para el diagnóstico etiológico de infecciones del tracto respiratorio, sistema nervioso central y del torrente sanguíneo, etc.10,11,12). Además, la mNGS puede cubrir un espectro más amplio de patógenos que las pruebas microbiológicas convencionales (CMT), como el cultivo bacteriano y fúngico, las pruebas serológicas y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), informando así mejor a los médicos sobre la elección adecuada de antibióticos.
Tradicionalmente, las muestras de esputo se han utilizado para la detección de patógenos en la bronquiectasia. Sin embargo, el esputo es susceptible a la contaminación oral y puede no reflejar con precisión la carga de patógenos en el tracto respiratorio inferior (en particular, distal). En este trabajo, nos propusimos evaluar la utilidad de las CMT y la mNGS para detectar patógenos y describir las características de los microorganismos en las vías respiratorias inferiores en la bronquiectasia. Además, investigamos la asociación entre el tipo o la carga de patógenos y el pronóstico en la bronquiectasia.
Métodos
Población de estudio y recolección de muestras
Los pacientes fueron reclutados entre el 17 de diciembre de 2020 y el 1 de septiembre de 2022 en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou, y fueron seguidos hasta el 1 de octubre de 2023 para registrar el tiempo hasta la siguiente exacerbación. Todos los pacientes tienen consentimiento informado por escrito. Los pacientes elegibles tenían 18 años o más y tenían un diagnóstico de bronquiectasia confirmado por tomografía computarizada de alta resolución (TCAR). Las exacerbaciones se definieron como síntomas respiratorios significativamente aumentados o de nueva aparición (tos crónica, infección, fiebre, esputo purulento, hemoptisis) que requirieron la administración de antibióticos según lo definido por la Sociedad Respiratoria Europea (13). El estado estable se definió como la ausencia de nuevos síntomas y ningún cambio en el tratamiento de la bronquiectasia en las últimas cuatro semanas (14). Se excluyó a los pacientes que no toleraban la broncoscopia. Los pacientes con bronquiectasias se sometieron a una broncoscopia de recolección de líquido de lavado broncoalveolar (BALF) al inicio de las exacerbaciones y durante el estado estable. La gravedad de la enfermedad se evaluó con el índice de gravedad de la bronquiectasia (BSI) y la puntuación E-FACED. La función pulmonar se evaluó mediante el volumen espiratorio forzado en un segundo (FEV1) y la relación FEV1/capacidad vital forzada (FVC). La duración de la enfermedad, el tiempo desde el primer diagnóstico de bronquiectasias por radiología, se registró durante la consulta de la historia clínica. El diagnóstico de la etiología infecciosa exacta de cada paciente se realizó de forma integral basándose en un estándar de referencia compuesto como informe previo (10), incluidos los resultados de CMT, los informes de mNGS, los hallazgos radiológicos, las presentaciones clínicas, la respuesta terapéutica a los antibióticos y la evaluación adicional de un panel de expertos independiente que incluye a dos médicos independientes.
CMT
Las pruebas de diagnóstico por imagen incluyeron cultivo de bacterias, micoplasma, clamidia y hongos, prueba de antígeno galactomanano, prueba de (1,3)-β-D-glucano y prueba de antígeno polisacárido criptococal. Se recogieron esputos y líquido amniótico líquido de cada paciente, se transportaron al laboratorio de microbiología y se procesaron (< 2 h) para cultivo. Se consideraron aptas las muestras de esputo con > 25 leucocitos y < 10 células epiteliales escamosas (en campo de bajo aumento). Se utilizaron agar sangre/chocolate (bioMérieux) y agar Sabouraud como medios de cultivo. Se utilizó PCR multiplex para la identificación de micobacterias no tuberculosas.
mNGS
El ADN de control interno (IC), un fragmento de ADN de doble cadena denominado «spike in control», se sintetizó, se amplificó mediante PCR (TAKARA PrimeSTAR® HS DNA Polymerase, Cat# R044) y se purificó utilizando perlas magnéticas (Matridx, Cat# MD012). Todos los procedimientos se realizaron dentro de una cabina de bioseguridad. Se realizó una cuantificación fluorométrica de Qubit en los amplicones (Thermo Fisher, Qubit dsDNA HS Assay Kit, Cat# Q32854). Las secuencias de nucleótidos del ADN de IC se han informado previamente. Los IC se agregaron a cada muestra de BALF antes de la extracción de ácido nucleico a una concentración final de 0,02 ng/μL. La biblioteca de secuenciación de ADN se preparó mediante fragmentación enzimática, reparación de extremos, adenilación terminal y ligadura de adaptadores (preparación de biblioteca NGSmaster™, Matridx, Cat# MAR002) (15). La concentración de bibliotecas de ADN se cuantificó mediante PCR en tiempo real (KAPA) y se agruparon. La secuenciación shotgun se llevó a cabo en la plataforma illumina Nextseq™. Se generaron aproximadamente 20 millones de lecturas de extremo único de 75 pb para cada biblioteca (16, 17). Para cada ejecución, se incluyó un control negativo (medio que contenía 106 células JURKAT/mL) para el control de calidad.
Las secuencias sin procesar se procesaron mediante un proceso bioinformático que incluía: 1) las secuencias adaptadoras y las bases de baja calidad (puntuación Q de corte de 20) se recortaron mediante Fastp (https://github.com/OpenGene/fastp); 2) Las lecturas del anfitrión se filtraron mediante el mapeo al genoma de referencia humano (GRCh38.p13) utilizando la alineación de Burrows Wheeler (BWA, http://bio-bwa.sourceforge.net) (18); 3) Después de eliminar las lecturas de baja complejidad, las secuencias restantes fueron alineadas por BWA con una base de datos de referencia interna (curada de la base de datos nt del NCBI (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/) y GenBank (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genbank/)) (18). Definimos que las lecturas con un 90 % de identidad con la referencia eran lecturas mapeadas. Además, las lecturas con múltiples alineaciones de locus dentro del mismo género se excluyeron del análisis secundario. Solo se consideraron las lecturas mapeadas al genoma dentro de la misma especie.
Las lecturas microbianas identificadas de una biblioteca se informaron si: 1) los datos de secuenciación pasaron los filtros de control de calidad (concentración de la biblioteca > 50 pM, Q20 > 85 %, Q30 > 80 %); 2) el control negativo en la misma ejecución de secuenciación no contiene la especie o las lecturas por millón (RPM) de la muestra/RPM del control negativo ≥ 5.
Cálculo del índice patogénico ajustado (API)
Para analizar la abundancia microbiana en BALF, utilizamos el índice patogénico ajustado (API) para reflejar la carga bacteriana de las especies microbianas como se describió anteriormente (19). Brevemente, para cada biblioteca, elegimos las lecturas mapeadas por millón (RPM) como el método de normalización para las lecturas mNGS como en el informe anterior (20). Las RPM se calcularon utilizando la fórmula: lecturas de genes /…
