Resumen
Antecedentes
Las primeras 24 h de infección representan una ventana de tiempo crítica en las interacciones entre los patógenos y el tejido del huésped. Sin embargo, no es posible estudiar eventos tan tempranos en el pulmón humano durante la infección natural debido a la falta de acceso clínico al tejido en una etapa tan temprana de la infección. Por lo tanto, aplicamos la secuenciación de ARN a explantes de tejido pulmonar humano (HLTE) cultivados ex vivo de pacientes con enfisema para estudiar los cambios globales en poblaciones pequeñas de ARN no codificante, ARNm y ARN largo no codificante (lncRNA, lincRNA) durante las primeras 24 h de infección. con el virus de la influenza A (IAV), Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) y Pseudomonas aeruginosa.
Resultados
Pseudomonas aeruginosa causó los cambios de expresión más fuertes y fue el único patógeno que afectó notablemente la expresión de microARN y ARN asociado a PIWI. Las principales clases de ARN largos (> 100 nt) estuvieron representadas de manera similar entre los ARN que se expresaron diferencialmente tras la infección con los tres patógenos (ARNm 77–82%; ARNlnc 15–17%; pseudogenes 4–5%), pero lnc- DDX60-1, RP11-202G18.1 y lnc-THOC3-2 eran parte de una firma de ARN (que además contenía SNX10 y SLC8A1) específicamente asociados con la infección por IAV. La infección por IAV indujo respuestas rápidas de interferón, siendo CCL8 el ARNm con mayor regulación positiva. La secuenciación de ARN unicelular identificó células epiteliales de las vías respiratorias y macrófagos como las células huésped predominantes del IAV, pero también se detectaron respuestas inflamatorias en tipos de células que expresan pocas o ninguna transcripción del IAV. El análisis combinado de datos de RNAseq en masa y unicelulares identificó un conjunto de 6 ARNm (IFI6, IFI44L, IRF7, ISG15, MX1, MX2) como la respuesta transcriptómica central a la infección por IAV. Los dos patógenos bacterianos indujeron cambios cualitativamente muy similares en la expresión del ARNm y predijeron vías de señalización, pero la magnitud del cambio fue mayor en la infección por P. aeruginosa. La regulación positiva de GJB2, VNN1, DUSP4, SerpinB7 e IL10, y la regulación negativa de PKMYT1, S100A4, GGTA1P y SLC22A31 se asociaron más fuertemente con la infección bacteriana.
Conclusiones
El tejido pulmonar humano generó respuestas transcriptómicas sustancialmente diferentes a la infección por IAV que por BCG y P. aeruginosa, mientras que las respuestas a estos dos patógenos bacterianos divergentes fueron sorprendentemente similares. Este modelo HLTE debería resultar útil para la investigación de la patogénesis dirigida por ARN y el descubrimiento de biomarcadores tisulares durante la fase temprana de las infecciones, tanto a nivel tisular como unicelular.
Introducción
Las primeras 24 h de infección forman una ventana de tiempo crítica en las interacciones entre muchos patógenos y el tejido del huésped, ya que incluyen la unión e invasión de células diana, el reconocimiento de patógenos por sensores celulares y, en muchos casos, los primeros ciclos de replicación del patógeno. . Los conocimientos sobre los cambios en la expresión del ARN del huésped son particularmente importantes para nuestra comprensión de esta fase temprana porque median en una parte importante de las respuestas tempranas inmediatas de células y tejidos al permitir los cambios coordinados necesarios en la expresión génica. Además, debido al alto rango dinámico en el cambio de expresión de ARN largos y la asociación de ARN pequeños como microARN (miARN) con interruptores reguladores centrales, las moléculas de ARN han demostrado un alto potencial como biomarcadores precisos para procesos específicos de enfermedades. Para las infecciones pulmonares, esto se ha demostrado predominantemente mediante análisis de ARN de sangre periférica de pacientes con enfermedad establecida (p. ej., (1,2,3)). Sin embargo, para capturar mejor los procesos fisiopatológicos en el propio órgano diana, sería muy deseable analizar el tejido pulmonar directamente. Si bien esto es técnicamente posible mediante biopsia transbronquial y puede estar clínicamente justificado en casos difíciles de diagnosticar, generalmente no es clínica o éticamente factible dentro de la fase muy temprana de la infección con un patógeno causante conocido. Aunque existen modelos de cultivo celular y animal bien establecidos para estudiar las infecciones del tracto respiratorio inferior humano, no pueden representar completamente los eventos observados en el tejido pulmonar humano intacto. El cultivo organotípico de explantes de tejido pulmonar humano (HLTE) se ha utilizado con éxito para superar algunos de estos inconvenientes. El modelo HLTE se basa en el cultivo ex vivo de tejido pulmonar humano que ha sido extirpado por motivos médicos, por ejemplo en el contexto de una cirugía tumoral o un trasplante de pulmón. La mayoría de los estudios han presentado una versión refinada del modelo HLTE basado en cortes de pulmón cortados con precisión (PCLS, revisado en las referencias).4, 5)). En este modelo, el tejido se incluye en agarosa de bajo punto de fusión y luego se secciona, preservando así mejor la arquitectura del tejido durante el cultivo posterior. Sin embargo, el modelo PCLS requiere mucha mano de obra e incrustar el tejido en agarosa puede interferir con análisis posteriores del tejido, por ejemplo mediante secuenciación de ARN. Por lo tanto, el modelo organotípico HLTE clásico sigue constituyendo una opción atractiva, en particular si se planean análisis de tejidos más sofisticados mediante tecnologías ómicas. En cuanto a las infecciones respiratorias, se ha demostrado que los HLTE pueden favorecer la invasión y replicación de patógenos virales, bacterianos y fúngicos y reproducir aspectos cardinales de las respuestas esperadas del huésped.6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17). En la mayoría de estos estudios se utilizaron márgenes de tejido libre de tumor procedentes de cirugía de tumores de pulmón, pero se utilizó con éxito tejido de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) para estudiar las respuestas de las citoquinas a H. influenza y al virus de la influenza A (IAV) (14, 17, 18) y el efecto antiinflamatorio del ácido citracónico sobre la infección por IAV (19). El tejido pulmonar explantado de pacientes con indicación de trasplante de pulmón por insuficiencia pulmonar por enfermedad pulmonar obstructiva sería, por lo tanto, una fuente atractiva de HLTE para estudios de infecciones de las vías respiratorias inferiores en centros médicos con un gran volumen de trasplantes de pulmón. Sin embargo, aún se desconoce si el tejido que se ha visto comprometido por un proceso patológico de larga duración que conduce a insuficiencia respiratoria no solo apoya la replicación de patógenos humanos clave ex vivo sino que también proporciona datos válidos sobre las respuestas transcriptómicas del huésped.
La secuenciación de ARN permite perfilar ARN largos y pequeños de diferentes clases a partir de una sola muestra, lo que se conoce como secuenciación integrativa de ARN. Para la investigación de infecciones, una característica particularmente atractiva es que la expresión de los ARN virales también se captura a partir de la misma muestra, lo que permite identificar células huésped infectadas y comparar las respuestas del huésped en células infectadas versus no infectadas (espectadores). Se ha empleado la secuenciación de ARN en masa y unicelular para caracterizar los cambios en la expresión de ARN en el tejido pulmonar humano. Por ejemplo, Alfi et al. aplicó la secuenciación masiva de ARN a HLTE de cirugía tumoral para evaluar las respuestas transcriptómicas al SARS-CoV-2 en el tracto respiratorio superior e inferior (16), mientras que la secuenciación de ARN unicelular (scRNAseq) de PCLS se utilizó recientemente para estudiar fármacos antivirales contra el SARS-CoV-2 (20). Sin embargo, no existen estudios que presenten scRNAseq o en masa de HLTE organotípicos para comparar las respuestas del tejido transcriptómico a patógenos virales versus bacterianos.
Los objetivos del presente estudio fueron (i) describir las diferencias en las respuestas transcriptómicas tempranas del huésped debido a infecciones virales versus bacterianas del tejido pulmonar humano ex vivo, (ii) analizar las respuestas del huésped al IAV a nivel unicelular, y ( iii) identificar tipos de células infectadas por IAV. Específicamente, hemos adaptado el cultivo de tejido HLTE de pacientes con indicación de trasplante de pulmón debido a enfisema avanzado y utilizamos (i) secuenciación integrada de ARN de clases de ARN pequeñas y largas para evaluar los cambios tempranos en la expresión del ARN después de la infección con IAV, Mycobacterium bovis Bacille Calmette- Guerin (BCG) y Pseudomonas aeruginosa, y (ii) secuenciación de ARN unicelular para identificar cambios en la expresión del ARNm del huésped y expresión de transcripciones virales en la infección por IAV a nivel unicelular. Encontramos que los explantes de tejido reproducen fielmente las respuestas esperadas específicas del patógeno a nivel tisular y unicelular y permiten (i) validar, en tejido humano, biomarcadores de ARN que habían sido previamente identificados en modelos celulares o animales, y (ii) el descubrimiento de nuevas moléculas de ARN asociadas a infecciones que puedan validarse en estudios futuros.
Resultados
Establecimiento del modelo de infección. El flujo de trabajo de un experimento típico se muestra en la Fig. 1R. Para optimizar la calidad del ARN para RNAseq, comparamos dos métodos para el aislamiento de ARN. En el primer método, los trozos de tejido pulmonar se incubaron con RNAlater durante 24 h a 4 °C y luego se almacenaron a -80 °C en RNAlater antes de la extracción. En el segundo método, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y luego se almacenaron a -80 °C. El método del nitrógeno líquido produjo números de integridad del ARN significativamente más altos (Fig. 1B) y, por tanto, se utilizó en todas partes. Medimos la liberación de LDH en HLTE no infectados e infectados con IAV para evaluar la degradación espontánea del tejido durante el cultivo y los posibles efectos citopáticos inducidos por virus. La LDH se liberó a lo largo de las 72 h, alcanzando valores máximos de aproximadamente el 7 % y el 12 % en HLTE infectados y no infectados, respectivamente, lo que indica un efecto citopático leve a moderado (Fig. 1DO). Para evaluar si el modelo HLTE respalda la liberación de partículas activas de IAV, empleamos el ensayo de inmunofocos para cuantificar las partículas de virus con capacidad de replicación en el sobrenadante y medimos la transcripción del ARN viral mediante la cuantificación del ARNm de HA. Se observó una aparente disminución de partículas de virus con capacidad de replicación en el sobrenadante durante un período de 72 h (Figura S1A). Esto probablemente se debió al hecho de que el inóculo viral inicial no fue reemplazado por un medio libre de virus y, por lo tanto, se concluyó que los títulos virales en el sobrenadante no podían usarse para medir la replicación viral. Por otro lado, la expresión del ARNm de HA viral aumentó de manera constante y alcanzó su punto máximo 48 h después de la infección (pi) (Fig. 1D). Sin embargo, importantes inter-…
