Resumen
Antecedentes
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad respiratoria muy extendida. Este estudio examina las vesículas extracelulares (EV) y las proteínas contenidas en las EV en la EPOC.
Métodos
Se recogieron muestras de sangre de 40 pacientes con EPOC y 10 controles sanitarios. Se midieron mediante ELISA citocinas que incluyen IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-17. Se extrajeron pequeñas muestras de vehículos eléctricos del plasma y se identificaron mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y transferencia Western. Los componentes proteicos contenidos en los vehículos eléctricos se analizaron mediante etiquetas de masa en tándem (TMT) para identificar proteínas diferenciales. Se extrajo EV derivado de Treg y se añadió a subconjuntos aislados de CD8+, Treg y Th17 para evaluar su efecto sobre los linfocitos T.
Resultados
ELISA reveló niveles más altos de todas las citocinas y la citometría de flujo sugirió una mayor proporción de células Treg y Th17 en pacientes con EPOC. Después de la identificación, el análisis TMT identificó 207 componentes proteicos únicos, incluidos cinco biomarcadores potenciales de la EPOC: BTRC, TRIM28, CD209, NCOA3 y SSR3. La citometría de flujo reveló que los vehículos eléctricos derivados de Treg inhibían la diferenciación en células CD8+, CD4+ y Th17.
Conclusión
El estudio muestra que las citocinas, las diferencias en los subconjuntos de linfocitos T en la EPOC y los vehículos eléctricos derivados de Treg influyen en la diferenciación de los linfocitos T. Los biomarcadores identificados pueden ayudar a comprender la patogénesis, el pronóstico y la terapia de la EPOC. El estudio contribuye a la investigación de biomarcadores de la EPOC.
Introducción
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una afección que se distingue por la presencia de síntomas respiratorios y limitación del flujo de aire que dura un período prolongado. Las partículas tóxicas, principalmente el humo del cigarrillo, han sido identificadas como el factor de riesgo más importante (1, 2). Los mecanismos subyacentes son complejos e incluyen una variedad de respuestas inmunes e inflamación crónica secundaria. Específicamente, los linfocitos T, incluidas las células T CD8+, las células T CD4+ y las células Th17, desempeñan un papel fundamental en la progresión y exacerbación de la EPOC al inducir estrés oxidativo y promover la liberación de factores proinflamatorios.3, 4).
Como se estudió anteriormente (5, 6), el desequilibrio Th1/Th2 ocurre comúnmente en la EPOC. Las respuestas mediadas por Th1 desempeñan un papel en el desarrollo de trastornos autoinmunes específicos de órganos, lo que conduce a lesión del tejido pulmonar, remodelación de las vías respiratorias y enfisema.4, 7). Las células Th17 son otro subconjunto de células T efectoras que secretan múltiples citocinas, como IL-17, IL-6 y CXCL 1, en el pulmón. Mientras tanto, Di Stéfano et al. (8) demostraron que las células Th17 y las citocinas asociadas pueden participar en la inflamación de las vías respiratorias y la remodelación de los tejidos de la EPOC.
Las vesículas extracelulares (VE) generalmente se refieren a partículas conocidas por una bicapa de fosfolípidos que se liberan de las células sin capacidad de autorreplicación.9). Debido a su complejidad composicional, los vehículos eléctricos desempeñan funciones importantes en la mayoría de los sistemas biológicos. Los vehículos eléctricos pequeños, que consisten principalmente en exosomas, se describieron como <200 nm de diámetro. Se ha informado que los vehículos eléctricos permiten regular la respuesta inmune (10).
Treg, una subpoblación de células T, secreta citoquinas inhibidoras como IL-10, IL-35 y TGF-β, para inhibir la función biológica de las células T efectoras.11). Además, se informa que las Treg inhiben la activación de las células T y B autorreactivas, lo que implica enfermedades autoinmunes (12,13,14). Además, también se ha descubierto que las Treg regulan las células T efectoras a través de exosomas paracrinos o endocrinos, un subconjunto de pequeños EV (15). Especialmente, los exosomas derivados de Treg mejoran las interacciones con otras células inmunes a través de sus diversas proteínas de la superficie de la membrana, regulando así la respuesta inmune. Los exosomas también impulsan respuestas inflamatorias y mejoran la activación inmune en la patogénesis de la EPOC (16). Por lo tanto, los vehículos eléctricos pequeños se consideraron biomarcadores potenciales para diagnosticar y clasificar la gravedad de la EPOC.
En este estudio, identificamos diferencias en las citocinas y proteínas de la sangre periférica en vehículos eléctricos pequeños entre pacientes con EPOC y humanos sanos. Además, investigamos el efecto de los vehículos eléctricos derivados de Treg de la EPOC en las células T CD4+, las células T CD8+ y las células Th17. Además, se identificaron 207 proteínas diferenciales mediante Tandem Mass Tags (TMT) y se seleccionaron y validaron 5 proteínas como posibles biomarcadores en la EPOC.
Materiales y métodos
Pacientes y controles.
En este estudio se inscribieron un total de 40 pacientes diagnosticados con EPOC en clínicas de medicina respiratoria para pacientes y 10 seres humanos sanos de la población de exámenes físicos. Todos los sujetos reclutados para esta investigación tenían entre 40 y 80 años y cumplían con los criterios de diagnóstico de la Iniciativa Global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (GOLD), definidos por un volumen espiratorio forzado en un segundo (FEV1) posbroncodilatador hasta la capacidad vital forzada ( FVC) relación inferior a 0,7 (17). Sin embargo, los sujetos fueron excluidos si tenían un diagnóstico de enfermedad cerebrovascular, inmunodeficiencia, infección activa o habían usado medicamentos que afectan la respuesta inflamatoria/inmune, o cualquier condición aguda o crónica que limitara la participación.
El grupo de control estuvo formado por 10 adultos sanos de entre 40 y 80 años sin antecedentes de enfermedades respiratorias, cardiovasculares u otras enfermedades crónicas, enfermedades infecciosas o inflamación, y que no estaban tomando ningún medicamento que pudiera afectar su estado inflamatorio u oxidativo. El período de inclusión fue de enero de 2022 a diciembre de 2022. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Afiliado al Hospital Universitario de ShaoXing (2021(yan)NO. 13). La información demográfica de los pacientes se enumera en la tabla T1.
ELISA
Después de recolectar las muestras de sangre, las muestras se centrifugaron a 1800 g durante 10 minutos para obtener suero. El contenido de todos los indicadores se determinó mediante los kits correspondientes según las instrucciones del fabricante.
La información de los kits utilizados en ELISA se enumeró de la siguiente manera: IFN-γ (MM-0033H1), TNF-α (MM-0122H1), IL-1β (MM-0181H1), IL-6 (MM-0049H1), IL- 8 (MM-1558H1) e IL-17 (MM-0180H1). Todos los kits se adquirieron en Jiangsu Enzyme Immune Industrial Co., Ltd.
Citometría de flujo
Se utilizaron 10 de las muestras de sangre de EPOC para detectar el fenotipo inmunológico de los linfocitos y las otras muestras de sangre se almacenaron a -80 ℃ para la extracción de vehículos eléctricos derivados de Treg y la clasificación de células T.
Se agregaron muestras de sangre a un tubo EP que contenía anticoagulante dentro de las 2 h y luego se transfirieron a un tubo EP nuevo que contenía PBS (1:1, v/v). Posteriormente, la muestra de sangre diluida se añadió a un medio igual de separación de linfocitos (P8610, Solarbio). Después de la centrifugación a 800 g durante 20 min, los linfocitos del medio fueron absorbidos por el gotero y luego se lavaron con PBS y se centrifugaron a 600 g durante 10 min, dos veces. Posteriormente, se descartó el sobrenadante y se añadieron 100 µL de PBS para resuspender las células. Se agregaron 2,5 µL de los anticuerpos correspondientes a la suspensión celular y luego se incubaron a 4 ℃ en la oscuridad durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron con 200 µl de PBS. Antes de subir a la máquina, las células pasaron por una criba de malla 200. El fenotipo inmune de los linfocitos se detectó mediante citometría de flujo multiparamétrica (NovoCytewas, Agilent).
Los anticuerpos utilizados en citometría de flujo fueron los siguientes: anticuerpo CD4 (sc-19641 PerCP, 1:20), anticuerpo CD8 APC (sc-1177 APC, 1:20), anticuerpo ISG20 FITC CD25 (sc-514979 FITC, 1:200 ), anticuerpo IL-17 PE (sc-374218 PE, 1:200). Todos los anticuerpos se adquirieron en SANTA CRU.
Extracción e identificación de vehículos eléctricos a partir de plasma.
Las muestras de sangre se colocaron en un tubo de recolección que contenía EDTA y luego se centrifugaron a 2000 ga 4 ℃ durante 15 minutos para obtener muestras de plasma. Posteriormente, las muestras de plasma se centrifugaron gradualmente en 2000 g a 4 ℃ durante 30 min y luego en 10.000 g a 4 ℃ durante 45 min. El sobrenadante se filtró con una membrana de 0,45 μm y luego se centrifugó a 100.000 g durante 70 minutos a 4 ℃. Después de resuspender en 500 µl de PBS 1 × preenfriado, las muestras aisladas se identificaron mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y transferencia Western.
TEM: Aplicar gota a gota 20 l de muestra sobre una malla de cobre, seguido de teñir con 10 l de acetato de dióxido de uranio (GZ02625, Zhongjingkeyi Tech.). Absorber el líquido con papel de filtro. Seque durante un rato y muestre la muestra en microscopía electrónica de 100 kV (HT-7700, Hitachi).
ANT: Las muestras se descongelaron y luego se diluyeron con 1x PBS. Después de la calibración y el enfoque, la muestra se añadió al analizador de seguimiento de nanopartículas (ZetaVIEW, PARTICLE METRIX) para analizar las trayectorias de las partículas y calcular la distribución del tamaño y la concentración de las partículas.
mancha occidental: Se añadió 5 × lisado de RIPA (P0013B, Beyotime) a las muestras, se mezcló en hielo durante 30 minutos y luego se midió la concentración de proteína con un kit BCA (P0012, Beyotime). Luego, se realizó la transferencia SDS-PAGE y PVDF. Miembro de PVDF (10600023, GE Healthcare Life) sellado con TBST de leche desnatada al 5 %. Se agregó el anticuerpo primario, se incubó a 4 ℃ durante la noche y a temperatura ambiente durante 1 h. Luego se visualiza con reactivos ECL utilizando un sistema de imágenes en gel (ChemiScope 3000mini, CLINX).
Los anticuerpos utilizados en la transferencia Western fueron los siguientes: anticuerpo GITR (Ab264419, Abcam); anticuerpo TSG101 (ab125011, Abcam); anticuerpo CD9 (A1703, Abclonal); anticuerpo CD63 (A5271, Abclonal); anticuerpo CD25 (13517, CST); anticuerpo CD39 (Ab300065, Abcam); anticuerpo CD73 (Ab133528, Abcam); anticuerpo CTLA-4 (Ab237712, Abcam); IgG de cabra anti-conejo peroxidasa conjugada (AP132P, Merck Millipore).
Análisis proteómico cuantitativo TMT.
TMT identificó los componentes proteicos diferenciales en vehículos eléctricos pequeños como estudios previos (18,19,20). Las concentraciones de componentes proteicos se detectaron mediante kits BCA (P0012, Beyotime). Posteriormente, las muestras de proteínas se transfirieron a un tubo de centrífuga para unificar el volumen. Añadir 5 l de ditiotreitol 1 M (43819, Sigma) y mantener a 37 ℃ durante 1 h; añadir 20 ml de yodoacetamida 1 M (I1149, Sigma) y reaccionar a temperatura ambiente durante 1 h, evitando la luz; transferir todas las muestras al tubo de ultrafiltración y centrifugar, luego desechar el sobrenadante. Añadir 100 µL de UA (urea 8 M, 100 mM…
