Resumen
Antecedentes
La apnea obstructiva del sueño (AOS), caracterizada por hipoxia crónica intermitente (CIH), es una afección prevalente que se ha asociado con diversas formas de cáncer. Aunque algunos estudios clínicos sugieren un vínculo potencial entre la AOS y el cáncer de pulmón, esta asociación sigue siendo incierta y los mecanismos subyacentes no se comprenden completamente. Este estudio investigó el papel del receptor catecolamina-β-adrenérgico (βAR) y el inflamasoma NLRP3 en la mediación de los efectos de la CIH en la progresión del cáncer de pulmón en ratones.
Métodos
Se sometieron ratones macho C57BL/6 N a CIH durante cuatro semanas, y se sembraron células de carcinoma de pulmón de Lewis por vía subcutánea. Durante este período se administró propranolol (un bloqueador de βAR) o nepicastat (un inhibidor de la producción de catecolaminas). Se controlaron el volumen del tumor y la presión arterial de la arteria de la cola. Se emplearon tinciones inmunohistoquímicas y tinciones de inmunofluorescencia para evaluar la expresión de proteínas de manchas Ki-67, CD31, VEGFR2, PD-1, PD-L1 y ASC en tejidos tumorales. Se utilizó ELISA para detectar catecolaminas y diversas citocinas, mientras que la transferencia Western evaluó la expresión de ciclina D1, caspasa-1 e IL-1β. El ensayo de formación de tubos in vitro investigó la angiogénesis. Se utilizaron ratones knockout para NLRP3 para determinar el mecanismo de NLRP3 en CIH.
Resultados
CIH condujo a un aumento de catecolaminas. Los fármacos inhibidores de catecolamina-βAR previnieron el aumento de la presión arterial causado por la CIH. En particular, los fármacos inhibieron el crecimiento de tumores de pulmón murinos inducidos por CIH y disminuyó la expresión de Ki-67, ciclina D1, CD31, VEGFR2, PD-1 y PD-L1 en el tumor. In vitro, el propranolol inhibe la formación de tubos inducida por el suero de ratón CIH. Además, la CIH provocó un aumento de los niveles de TNF-α, IL-6, IL-1β, IFN-γ y sPD-L1 y una disminución de la IL-10 en sangre periférica, acompañado de la activación de los inflamasomas NLRP3 en el tumor, pero estos Los efectos también fueron detenidos por las drogas. En ratones knockout para NLRP3, se inhibió la regulación positiva inducida por CIH de PD-1/PD-L1 en el tumor.
Conclusiones
Nuestro estudio subraya la contribución significativa de la señalización β-adrenérgica y el inflamasoma NLRP3 a la progresión del cáncer de pulmón inducido por CIH. Estas vías representan posibles objetivos terapéuticos para mitigar el impacto de la AOS en el cáncer de pulmón.
Fondo
La apnea obstructiva del sueño (AOS) es un trastorno generalizado caracterizado por oclusiones repetitivas de las vías respiratorias superiores durante el sueño, lo que lleva a hipoxia crónica intermitente (CIH), aumento de los esfuerzos respiratorios y fragmentación del sueño.1). Su prevalencia ha aumentado gradualmente en los últimos años y se estima que afecta a casi mil millones de personas en todo el mundo (2). En las últimas décadas, los datos clínicos, junto con experimentos in vivo e in vitro, apuntan a mecanismos clave subyacentes a las enfermedades relacionadas con la AOS, incluida la activación del nervio simpático, el estrés oxidativo y la inflamación.3). La AOS, como factor de riesgo independiente, está estrechamente relacionada con muchas enfermedades, como las enfermedades cardiovasculares, el deterioro cognitivo y los trastornos metabólicos (1). Este impacto multifacético subraya las consecuencias de gran alcance de la AOS en la salud general. En particular, las investigaciones emergentes sugieren una asociación notable entre la AOS y la prevalencia e incidencia del cáncer (4, 5).
El cáncer de pulmón tiene la sombría distinción de ser la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer (6). La posible conexión entre la AOS y el cáncer de pulmón ha despertado interés. Algunos estudios indican un vínculo notable, revelando que las personas con AOS enfrentan un riesgo aproximadamente un 30% mayor de desarrollar cáncer de pulmón en comparación con aquellos sin AOS (7). Además, la gravedad de la AOS en una cohorte de sueño se asocia con un mayor riesgo de muerte en pacientes con cáncer de pulmón en estadio III y IV (8). Sin embargo, la relación entre la AOS y el cáncer de pulmón sigue siendo polémica, marcada por resultados contradictorios en varios estudios (9, 10). Este debate ha estimulado un creciente conjunto de investigaciones que profundizan en las intrincadas conexiones. CIH, una característica clave de la AOS, ha surgido como un factor crítico que vincula la AOS con el cáncer de pulmón. Hye y col. descubrió que los CIH promueven la progresión del cáncer de pulmón murino, y el efecto puede estar relacionado con la señalización de Wnt/β-catenina y la señalización de Nrf2 (11). Además, Noelia et al. confirmó el papel crucial de la señalización de la COX-2 en la progresión del cáncer de pulmón exacerbado por CIH (12). Se puede observar que el impacto de la CIH en el cáncer de pulmón es multifacético. Sin embargo, es necesario seguir explorando para descubrir los mecanismos más profundos que intervienen en esta relación.
El eje simpático-adrenomedular es un importante sistema neuroendocrino que desempeña un papel esencial en el estrés crónico. El aumento de la actividad del nervio simpático eferente es uno de los mecanismos patológicos en pacientes con AOS. Curiosamente, la AOS provoca elevaciones crónicas en las concentraciones de catecolaminas plasmáticas en adultos y niños (13, 14), y estos hallazgos se han demostrado en animales expuestos a CIH (15). Las catecolaminas, incluidas la dopamina (DA), la noradrenalina (NE) y la epinefrina (EPI), se someten a un proceso de conversión. La DA se transforma en NE mediante la dopamina β-hidroxilasa (DBH), y la NE genera EPI mediante la transmetilación de feniletanolamina-N-metiltransferasa. La DA afecta principalmente al sistema nervioso central, mientras que la NE y la EPI, conocidas por su papel en la respuesta de “lucha o huida”, actúan a través de los receptores α-adrenérgicos (α-AR) y β-adrenérgicos (β-AR) (16).
La activación del sistema nervioso simpático, que provoca una liberación significativa de catecolaminas, es un factor reconocido en el cáncer relacionado con el estrés.17). Mencionó que la NE inducida por estrés activa la señalización de β-AR y promueve la proliferación de células de adenocarcinoma ductal pancreático a través de inervación simpática o acumulación local. Además, en muchos tumores sólidos, como los cánceres de ovario y páncreas, la EPI aumenta la expresión de VEGF, promoviendo la angiogénesis tumoral mediante la activación de β2-AR-HIF-1α (16). Además, la elevación crónica de catecolaminas inducida por el estrés puede inhibir la respuesta inmune y contribuir a la evasión inmune del tumor.16). En resumen, estos hallazgos resaltan el papel esencial de las catecolaminas-βAR en la promoción del cáncer. Sin embargo, no está claro si el aumento crónico de catecolaminas contribuye a la progresión del cáncer de pulmón en ratones causado por CIH, y el mecanismo es incierto.
En pacientes con AOS, se ha descubierto que la CIH mejora la respuesta inflamatoria basal, desempeñando un papel clave en el desarrollo de algunas enfermedades, como las enfermedades cardiovasculares.18). El inflamasoma NLRP3 (proteína 3 del receptor similar al dominio de oligomerización de unión a nucleótidos) es un sensor intracelular que activa la inflamación. Consiste en NLRP3, ASC (proteína tipo mota asociada a la apoptosis con un dominio de reclutamiento de caspasa) y pro-caspasa-1. Cuando se activa, este complejo desencadena la activación de la caspasa-1, lo que conduce a la liberación de citocinas proinflamatorias, como la IL-1β y la IL-18, que provocan la inflamación. Los estudios han demostrado que los inflamasomas NLRP3 pueden ser objetivos clave para controlar la inflamación en enfermedades crónicas (19). La evidencia también sugiere que la activación de NLRP3 es una respuesta temprana a la hipoxia y está regulada por el factor 1-alfa inducible por hipoxia (HIF-1α) (20). Dado que CIH promueve la inflamación sistémica y el papel de NLRP3 en este proceso, planteamos la hipótesis de que NLRP3 podría ser un mediador crucial de la progresión del cáncer de pulmón inducido por CIH.
El propósito de este estudio es explorar el mecanismo por el cual la señalización de catecolamina-βAR y los inflamasomas NLRP3 contribuyen a los efectos de la CIH en la progresión del cáncer de pulmón, con el objetivo de identificar posibles objetivos terapéuticos dentro de estas vías de señalización.
Métodos
cultivo celular
Se adquirieron células de carcinoma de pulmón de Lewis de ratón (LLC) y células SVEC4-10 de la Infraestructura Nacional de Recursos de Líneas Celulares (Shanghai, China). Todas las células se incubaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS, 2115802RP, Gibco, Life Technologies Australia Pty Ltd, Australia) y penicilina/estreptomicina al 1% a 37 ℃ en una atmósfera humidificada con 5 %CO2.
Ensayo del kit de recuento celular-8 (CCK-8)
La viabilidad celular se midió con un ensayo CCK-8 (MC0301, Jackson Bio). Se sembraron células SVEC4-10 a una densidad de 3 x 103 células/pocillo en placas de 96 pocillos. En espera de adherencia, las células se incubaron con propranolol 0, 0,5, 1, 2, 5 y 10 µM durante 48 h. Según las instrucciones del kit, se agregaron 10 µl de solución CCK-8 a cada pocillo y se incubaron a 37 ℃ durante 4 h. Luego, se midió la absorbancia de cada pocillo a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Epoch2, Biotek, Formant, EE. UU.).
Animales y exposición crónica a hipoxia intermitente.
Se adquirieron setenta y dos ratones macho C57BL/6 N de 6 semanas de edad (que pesaban entre 19 y 21 g) de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology (China). El profesor Xianwei Wang (Universidad Médica de Xinxiang, Henan, China) donó ratones macho C57BL/6 N NLRP3 knockout de 6 semanas de edad. Todos los ratones se alojaron en jaulas estándar con un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 horas y tuvieron libre acceso a agua y comida. El bloqueador β-AR propranolol (Prop) y el inhibidor de la dopamina β-hidroxilasa nepicastat (Nepi) utilizados en el experimento se adquirieron de Yabang Epson Pharmaceutical Co., Ltd (Jiangsu, China) y Adooq, China, respectivamente. Se disolvió un g de polvo de carboximetilcelulosa sódica (CMC-Na, Sangon Biotech) en 100 ml de agua ultrapura en un baño de agua a 60 °C, que se utilizó como vehículo.
La exposición a CIH se logró con un controlador de O2 (Oxycycler A84XOV, BioSpherix, EE. UU.). El patrón consistió en ciclos de 30 s de FiO2 0,21 (21%) seguidos de 20 s de FiO2 0,06 (6%) durante 8 h todos los días. Este patrón imita las oscilaciones de la saturación arterial de oxígeno observadas en pacientes con AOS moderada. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a seis grupos (n = 12 en cada grupo): control más vehículo (Con + Vehi), control más propranolol (Con + Prop), control más nepicastat (Con + Nepi), CIH más vehículo (CIH + Vehi), CIH más propranolol…
