Resumen
Antecedentes
La complejidad del asma, marcada por la inflamación y remodelación de las vías respiratorias, se ve influida por las condiciones hipóxicas. Este estudio se centra en el papel del factor inducible por hipoxia-1 alfa (HIF-1α) y la ubiquitinación de P53 en la exacerbación del asma.
Métodos
Se utilizaron técnicas de secuenciación de alto rendimiento y bioinformática para identificar genes asociados con la progresión del asma, con énfasis en los análisis de las vías GO y KEGG. Se desarrolló un modelo murino de asma y se aislaron células de músculo liso de las vías respiratorias (ASMC) para crear un modelo de hipoxia in vitro. Se evaluaron la viabilidad celular, la proliferación, la migración y la apoptosis, junto con la tinción ELISA y de hematoxilina y eosina (H&E).
Resultados
Se observó un aumento notable de HIF-1α en modelos de asma tanto in vivo como in vitro. La sobreexpresión de HIF-1α mejoró la viabilidad, la proliferación y la migración de las ASMC, al tiempo que redujo la apoptosis, principalmente a través de la promoción de la ubiquitinación de P53 a través de MDM2. Los estudios in vivo mostraron un aumento de la infiltración de células inflamatorias y cambios estructurales en las vías respiratorias, que fueron mitigados por el inhibidor IDF-11,774.
Conclusión
El estudio destaca el papel fundamental del eje HIF-1α-MDM2-P53 en el asma, lo que sugiere su potencial como objetivo para intervenciones terapéuticas. Los hallazgos indican que la modulación de esta vía podría ofrecer nuevas vías para el tratamiento del complejo trastorno respiratorio del asma.
Introducción
Como enfermedad inflamatoria crónica, el asma se caracteriza por síntomas recurrentes como sibilancia, dificultad para respirar y tos (1). La patogenia de esta enfermedad es compleja e implica interacciones entre genes, medio ambiente y factores inmunes (2). En los últimos años, la remodelación de las vías respiratorias y la inflamación de las vías respiratorias asociadas con el asma se han convertido en temas de investigación candentes, ya que están directamente relacionados con los procesos patológicos y fisiológicos y las manifestaciones clínicas del asma (3). La remodelación de las vías respiratorias implica el engrosamiento del músculo liso de las vías respiratorias, la hiperplasia de las glándulas submucosas y la deposición de colágeno. Estos cambios dan lugar a una mayor hiperreactividad de las vías respiratorias, lo que conduce a una mayor gravedad e irreversibilidad del asma (4). La inflamación de las vías respiratorias promueve la hinchazón y la congestión de la pared de las vías respiratorias, lo que aumenta la secreción de moco y exacerba aún más el estrechamiento y la obstrucción de las vías respiratorias (5).
La hipoxia se observa a menudo en diversas enfermedades, incluido el asma (6, 7). Las condiciones hipóxicas podrían inducir cambios en muchas células y moléculas, afectando así la función de los tejidos y órganos.8,9,10). Uno de los factores de transcripción clave inducidos por el bajo nivel de oxígeno es el HIF-1α (factor inducible por hipoxia-1 alfa), que se regula positivamente en condiciones hipóxicas y desempeña un papel en varios procesos biológicos como el metabolismo celular, la proliferación, la migración y la apoptosis (11,12,13). Los estudios sugirieron que el factor inflamatorio TNF-α afecta la funcionalidad de las células del músculo liso de las vías respiratorias (ASMC) y, en consecuencia, el desarrollo de enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias al regular los niveles de expresión de proteína y ARNm de HIF-1α (14). Sin embargo, el papel del HIF-1α en la inflamación de las vías respiratorias inducida por el asma y en la inducción de la remodelación de las vías respiratorias sigue sin estar claro. Además, los mecanismos moleculares específicos a través de los cuales el HIF-1α regula la vitalidad, la proliferación, la migración y la respuesta inflamatoria de las células madre asmáticas aún no se comprenden por completo.
P53 es una proteína supresora de tumores importante en la regulación del ciclo celular, la reparación del ADN y los procesos de apoptosis celular (15). La ubiquitinación, como mecanismo esencial de degradación de proteínas, podría verse facilitada por la acción de MDM2 para promover la ubiquitinación de P53, afectando así la estabilidad y la actividad de P53 (16). Algunos estudios sugieren que la ubiquitinación de P53 puede estar asociada con la remodelación de las vías respiratorias y la inflamación de las vías respiratorias en el asma (17). Investigaciones recientes indican que HIF-1α puede suprimir la expresión de PPP1R1B, inhibiendo así la degradación de la proteína p53 (9). Además, numerosos estudios han demostrado una relación reguladora entre HIF-1α y p53 (18). Sin embargo, los mecanismos por los cuales HIF-1α influye en la ubiquitinación de P53 a través de la regulación de MDM2, y posteriormente impacta en la remodelación de las vías respiratorias y la inflamación en el asma, siguen sin resolverse (19).
Nuestra investigación tiene como objetivo explorar cómo la regulación positiva de HIF-1α inducida por el bajo nivel de oxígeno promueve la ubiquitinación de P53 a través de la regulación de MDM2, lo que exacerba la inflamación de las vías respiratorias en el asma e induce la remodelación de las vías respiratorias a través de una serie de experimentos in vitro e in vivo. Hemos empleado secuenciación de alto rendimiento, análisis bioinformático, modelos de ratón y varias técnicas de biología celular para profundizar en este mecanismo (20). Este estudio es útil para revelar la patogenia del asma y puede proporcionar nuevos objetivos y estrategias para el diagnóstico y el tratamiento de esta enfermedad. La comprensión de este mecanismo ayuda a optimizar los planes de tratamiento, mejorar el manejo del paciente y proporcionar una base para el desarrollo de fármacos y terapias futuras. Una mejor comprensión de los roles de la hipoxia, HIF-1α, MDM2 y P53 en el asma puede contribuir al desarrollo de estrategias de tratamiento más específicas y efectivas, lo que conduce a un mejor pronóstico y calidad de vida para los pacientes con asma.
Materiales y métodos
Construcción de un modelo de ratón asmático
Adquiera 45 ratones BALB/c hembras sanas, de 4 a 6 semanas de edad y con un peso de 18 a 22 g, del Centro de Investigación Animal de Laboratorio de Shanghái. Aloje a cada ratón por separado en un laboratorio para animales de grado SPF. La humedad del laboratorio es del 60 al 65 %, la temperatura es de 25 ± 2 ℃ y se proporciona acceso libre a comida y agua en condiciones alternas de luz y oscuridad de 12 horas. El experimento comienza una semana después de la adaptación al régimen de alimentación y se observa el estado de salud de los ratones antes del experimento. El protocolo experimental y el plan de uso de los animales han sido aprobados por el Comité de Ética Animal (21).
Se indujo asma en ratones mediante inyección intraperitoneal de 20 µg de ovoalbúmina (OVA, número de catálogo: 77.120, Thermo Scientific™, EE. UU.) y 1 mg de gel de hidróxido de aluminio (número de catálogo: 1.017.502, Sigma-Aldrich, Alemania) los días 0, 7 y 14. Las inyecciones se administraron en 0,2 ml de solución salina estéril. A partir del día 21, los ratones se colocaron en una cámara de nebulización hermética hecha a medida y se expusieron a un aerosol de OVA al 1 % durante 30 minutos al día durante siete días consecutivos. Antes de cada inhalación, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 0,2 ml de solución salina antes de la inducción del asma. Los ratones del grupo de control fueron sensibilizados y desafiados de la misma manera, pero con solución salina en lugar de OVA. El procedimiento fue consistente con el grupo de asma. Además, se inyectaron intraperitonealmente 0,2 ml de solución salina 30 minutos antes de cada nebulización (22,23,24).
Examen histológico
El tejido pulmonar del ratón se fijó en una solución de paraformaldehído al 4% y se remojó durante 24 h. Luego, se realizó una inclusión de parafina de rutina para crear secciones consecutivas de 4 μm. Se utilizó diclorometano para desparafinar y luego se trató con alcohol de diferentes concentraciones (95%, 90% y 85%), seguido de un lavado con xileno durante 10 min. Luego, se utilizó alcohol de ácido clorhídrico durante 5 s de coloración, seguido de una deshidratación con alcohol de diferentes concentraciones (85%, 90%, 95%, 100%) y, finalmente, un tratamiento transparente con diclorometano. Finalmente, se utilizó resina neutra para sellar la muestra. Los resultados se observaron bajo un microscopio óptico (x 200, Olympus, Tokio, Japón) (25).
Secuenciación de alto rendimiento de muestras de tejido pulmonar de ratones asmáticos
Después de establecer un modelo de asma en ratones BALB/c, se obtuvieron muestras de tejido pulmonar de tres ratones del grupo sin asma y tres ratones del grupo con asma. Se extrajo el ARN total utilizando un kit de aislamiento de ARN total (número de catálogo: 12.183.555, Invitrogen, EE. UU.) de las seis muestras y se cuantificó el valor de DO del ARN total. La integridad de estas muestras de ARN total se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa. El ARN total de alta calidad se transcribió de forma inversa en ADNc para construir una biblioteca de ARN, que se secuenció utilizando la plataforma NextSeq 500 de Illumina. Los datos de imágenes sin procesar obtenidos de la secuenciación se convirtieron en lecturas sin procesar mediante la llamada de bases. Para garantizar la calidad de las lecturas sin procesar, se utilizó cutadapt para eliminar las secuencias adaptadoras de secuenciación y filtrar las secuencias de baja calidad, y las lecturas restantes se denominaron «lecturas limpias». Las secuencias se alinearon con el genoma de referencia del ratón utilizando el software Hisat2, y la expresión genética se cuantificó utilizando el paquete de software R, lo que dio como resultado una matriz de expresión genética (26).
Análisis bioinformático
Se realizó un análisis bioinformático de datos de secuenciación de alto rendimiento utilizando el paquete “limma” en lenguaje R para realizar un cribado de expresión diferencial de LncRNA y mRNA. El cribado se basó en un valor P < 0,05. Utilice el paquete ggplot2 para trazar un gráfico de volcanes y el paquete pheatmap para trazar un mapa de calor. Dibuje un diagrama de Venn utilizando la base de datos académica Xiantao.
Recupere y descargue conjuntos de genes relacionados con la inflamación y la remodelación de las vías respiratorias en la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org/). Busque y descargue conjuntos de genes relacionados con la inflamación de las vías respiratorias utilizando la base de datos PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/). Se realizó un análisis de interacción proteína-proteína en proteínas codificadas por genes diana candidatos utilizando la base de datos STRING (https://cn.string-db.org/), y se construyó un gráfico de red de interacción de proteínas utilizando el software Cytoscape v3.10.0. Predicción de los genes de la proteína de unión de HIF-1α utilizando la base de datos BioGRID (https://thebiogrid.org/) y HitPredict (http://www.hitpredict.org/). Realice análisis KEGG y PANTHER utilizando la base de datos KOBAS (http://bioinfo.org/kobas), y realizar análisis de enriquecimiento de vías y generar gráficos tanto para la ontología de enfermedades (DO) como para la ontología de genes (GO) utilizando los paquetes “clusterProfiler”, “org.Hs.eg.db”, “enrichplot”, “DOSE” y “ggplot2” en lenguaje R…
