Resumen
Antecedentes
El asma es un trastorno respiratorio frecuente con una estrategia de tratamiento limitada. El neuropéptido S (NP) es un péptido altamente conservado a través de la unión a su receptor NPSR, un gen de susceptibilidad para el asma de los estudios genómicos. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de NPS-NPSR en la patogénesis del asma. Este estudio se realizó para determinar el efecto y el mecanismo subyacente de NPS-NPSR en el asma.
Métodos
La eliminación de NPSR se verificó para afectar el asma a través de la autofagia por secuenciación del transcriptoma y experimentos de biología molecular en modelos animales. Silenciamiento del factor de transcripción EB en una línea celular epitelial bronquial y la validación de la activación de NPS-NPSR de la autofagia que depende del factor de transcripción EB.
Resultados
Nuestros resultados mostraron que la expresión de NPSR aumentó notablemente en humanos y ratones asmáticos, principalmente localizados en células epiteliales bronquiales. Usando modelos de ratón de ovalbúmina (OVA) y de ratón de asma inducidos por papaína, los ratones deficientes en NPSR exhibieron un asma significativamente aliviada, con pequeñas lesiones de vías respiratorias reducidas e infiltración inflamatoria en comparación con ratones de tipo salvaje. OVA y Papain promovieron la autofagia mediada por TFEB con una mayor expresión de ATG5 y LC3 II, y los NP regularon efectivamente la activación de TFEB y autofagia. A su vez, la eliminación específica de TFEB podría restaurar el efecto de los NP exógenos y su antagonista del receptor en la secreción de autofagia y citocinas en células epiteliales bronquiales. Además, PRKCG puede ser la orientación aguas arriba de la vía TFEB-Autofagy involucrada en el asma.
Conclusiones
NPS-NPSR exacerbó el asma mediante la regulación del eje TFEB-Autofagia en la lesión epitelial de las vías respiratorias, que puede ser un objetivo potencial para la terapia con asma.
Introducción
El asma es una enfermedad respiratoria compleja caracterizada por hiperreactividad bronquial, obstrucción del flujo de aire variable e inflamación de las vías respiratorias. La prevalencia del asma ha aumentado y afecta a más de 300 millones de personas, lo que implica una pesada carga socioeconómica (1). Se han propuesto múltiples elementos para contribuir a la patogénesis del asma, incluidos los factores genéticos, la respuesta inmunológica, la mediación ambiental y farmacológica (2, 3). Por lo tanto, hay fenotipos heterogéneos, con los mecanismos patogenéticos subyacentes poco conocidos. Es urgente identificar vías cruciales involucradas en el asma y guiar el desarrollo de objetivos terapéuticos de manera efectiva (2).
Las células epiteliales respiratorias (EC) son la primera barrera de defensa contra la exposición a estímulos como patógenos, contaminantes, alérgenos e incluso el microbioma pulmonar. Se ha reconocido bien que las CE juegan un papel vital en la provisión de asma (4). Muchos de los genes de susceptibilidad identificados para el asma, como MUC5AC (mucina 5ac), IL33 (interleucina 33), IL1R1 (receptor de interleucina 1 tipo 1) y TSLP (tímica estromal linfopoyetina), se expresan predominantemente por las células epiteliales (5). A su vez, se ha identificado la disfunción de la barrera epitelial para aumentar la inhalación de alérgenos (6), con más liberación de citocinas Th2 típicas, lo que resulta en una inflamación respiratoria significativa y la remodelación de las vías respiratorias que contribuyen a la patogénesis del asma (7). Por lo tanto, las CE han surgido como un importante impulsor del desarrollo del asma. El tracto respiratorio se divide anatómicamente en los tractos respiratorios superiores e inferiores. The upper respiratory tract includes the nasal cavity, pharynx, and larynx, while the lower respiratory tract comprises the conducting airways (trachea, bronchi, and bronchioles) and the respiratory zones (respiratory bronchioles and alveoli) (8, 9). Las células epiteliales que recubren el tracto respiratorio difieren en el tipo y la función dependiendo de su ubicación anatómica. Entre estos, las células epiteliales bronquiales son particularmente críticas para la investigación en el contexto del asma (10, 11).
La autofagia es un proceso metabólico altamente conservado en el que las proteínas anormales y los orgánulos deteriorados se entregan y degradan en el lisosoma (12). Como un mecanismo importante de control de calidad celular, se ha demostrado que la autofagia juega un papel importante en la respuesta inflamatoria, la secreción de citocinas y la remodelación de las vías respiratorias, promoviendo así o agravando diversas enfermedades pulmonares inflamatorias (13, 14). Recientemente, los genes relacionados con la autofagia, incluidos ULK1 (UNC-51, como la quinasa activadora de la autofagia, 1), MAPLC3B (Proteína 1 de microtúbulos asociada a la cadena ligera 3 Beta), Beclin-1 y Atg5 (autofagia relacionada con 5)14,15,16). Por ejemplo, la expresión de ATG5 en pacientes con asma es mayor en los pulmones de pacientes con asma y modelos de ratones en comparación con los pulmones normales (17); La sobreexpresión de los genes relacionados con la autofagia perjudica la función epitelial bronquial en el asma (14, 15); e IL-13 (interleucina 13) activa la autofagia en las células epiteliales de las vías respiratorias traqueales humanas diferenciadas para dirigir la secreción de mucina y las respuestas de estrés oxidante celular (18, 19). Estos hallazgos sugieren una dirección importante para el tratamiento con asma mediante el objetivo del proceso de autofagia. Sin embargo, el mecanismo de promover la autofagia durante la progresión del asma no se ha entendido por completo.
El neuropéptido S (NP) es un péptido altamente conservado que se encuentra en todos los tetrápodos que es secretado por las células neuroendocrinas. A través de su receptor de receptor de superficie celular de proteína G acoplado a S receptor S (NPSR1), NPS juega un papel importante en múltiples respuestas neuroendocrinas, conductuales e inflamatorias ((20, 21). NPSR1 se descubrió como un gen de susceptibilidad para el asma y los rasgos relacionados mediante la clonación posicional. Además, la correlación de los polimorfismos de un solo nucleótido NPSR1 (SNP) con asma se ha replicado en poblaciones étnicamente diversas (22,23,24), y apoyado por un estudio de asociación de genoma a gran escala (GWAS) (25). Recientemente, se encontró una expresión elevada de NPS y su receptor en las vías respiratorias, el tejido pulmonar y el fluido de lavado alveolar de los asmáticos, mientras que en las células de sangre y esputo, se identificaron grandes monocitos/macrófagos y eosinófilos como células positivas para NPSR (26, 27). Sin embargo, la función específica y el mecanismo subyacente del sistema NPS-NPSR en el asma siguen sin estar claros.
En este estudio, investigamos los efectos de NPS-NPSR en los modelos de asma de ratones, lo que demuestra que la autofagia aberrante en las células epiteliales controladas por el eje NPS-NPSR contribuyó a la progresión de OVA y el asma inducida por papaína. También proporcionamos el mecanismo molecular involucrado en este proceso de autofagia. El presente estudio proporciona nuevos objetivos terapéuticos para controlar el asma.
Material y métodos
Animales
Los ratones C57BL/6 se adquirieron de Spearfish (Beijing) Biotechnology Co. Los ratones con deficiencia de NPSR (C57BL/6J-NPSR1EM1CYA) se adquirieron en Sayer (Suzhou) Biotechnology Co. Cada jaula de 5 ratones se alojó en condiciones específicas libres de patógenos libres de condiciones climá ciclo). Los procedimientos que involucran ratones fueron aprobados por el Comité de Enseñanza de Cuidado y Uso de Animales JNU (JN. No20230830M0880315 (350), fecha de aprobación 30/3/30/2023).
Regentes
El OVA (A5253) se obtuvo de Sigma-Aldrich; Papain (T19503) se adquirió de Taojitsu; El adyuvante de inyección de alumbre (77161) se adquirió de Thermo Fisher Scientific; El anticuerpo anti-NPSR (ORB158023) se adquirió de Biorbyt; Anticuerpo anti-EP-CAM (G8.8): SC-53532; Antibuerpos anti-ATG5 (#12994), anticuerpo anti-LC3B (#3868S), anticuerpo anti-BeClin-1 (#3495 T), anticuerpo anti-P62 (#23214S) se adquirieron de la tecnología de señalización celular (Danvers, MA, MA, MA, EE. UU.), Β-actina (#21338) se adquirió desde Signadyway Antibody (College de Signady (MDA, MDE, USA), β-Actina (#21338). El anticuerpo anti-TFEB #41488 y el anticuerpo anti-PRKCG #55375 fueron de anticuerpos de citometría de flujo, incluidos los anticuerpos FIT CD170 (SIGLEC-F) FITC (SIGLEC-F) (S17007L) y CD11C anti-ratón PE (N418) de BioLegend y Thermofisher, respectivamente. Beyotime proporcionó el kit de detección de proteínas BCA (P0012S) y DAPI (C1002).
Modelos animales
En el modelo de asma inducido por OVA, utilizamos ratones hembras de 6 a 8 semanas de edad. Como se informó anteriormente (28,29,30), en los días 0 y los días 10, sensibilizamos con alumbre adyuvante de alumbre 2 mg Demulsificado OVA 75 μg por vía intraperitoneal y aseguramos que el volumen total inyectado fuera de 200 μl. Bajo anestesia de isoflurano, los ratones recibieron OVA (50 μg en 40 μl de PBS) intraductalmente en los días 21, 22 y 23, respectivamente. Los ratones fueron necropiados el día 25, y la sangre periférica, la balf (líquido de lavado broncoalveolar) y el tejido pulmonar se recogieron para su posterior estudio. En el modelo de papaína, administramos Papain (30 μg en 40 μl de PBS) intratraqueal a ratones hembras (6–8 semanas) continuamente los días 0, 1 y 2 durante 3 días y los ejecutamos el día 7.
Recolección y análisis de fluido de lavado broncoalveolar
Los pulmones se lavaron dos veces con 1 ml de PBS estéril, y se recolectó fluido de lavado bronquial del modelo de asma y ratones de control. 4 ° C y 500 g durante 5 minutos se resuspendieron en PBS y se contaron, y el sobrenadante se analizó para la concentración de proteína utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA.
Ensayo histológico de pulmón
Los tejidos pulmonares (lóbulo inferior izquierdo) se fijaron con paraformaldehído al 4%, deshidratados e incrustados en parafina, y posteriormente se cortaron en secciones de 4 μm. Las secciones de tejido pulmonar se tiñeron con tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de ácido periódico-esquiff (PAS) para evaluar los niveles de inflamación y mucina en los bronquios.
Ensayo de citometría de flujo y clasificación celular
Las células se obtuvieron de BALF, se lisaron para eritrocitos y se centrifugaron y se resuspendieron para la tinción de superficie por incubación con anticuerpos de flujo CD11c y anticuerpos Siglec-F anti-ratón durante 30 minutos a 4 ° C. Las células con baja expresión de CD11C y alta Siglec-F se clasificaron por citometría de flujo (BD y FACS ARIA III). Cada linaje celular se identificó de la siguiente manera: Eosinófilos (EOS), CD11C-SIGLEC-F+.
Cultivo celular y transfección
Las células BEAS-2B (XY Biotechnology, China) se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO₂ y 95% de humedad relativa, utilizando DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Gibco, EE. UU.) …
(Tagstotranslate) Neuropéptido S (T) Astma (T) Célula epitelial bronquial (T) Autofagia (T) TFEB (T) Sistema de neumología/respiratoria
