Microscopía electrónica de transmisión de muestras de criobiopsia pulmonar transbronquial en una cohorte de pacientes con enfermedad pulmonar intersticial fibrótica: viabilidad e implicaciones de las alteraciones endoteliales

Resumen

Evaluamos la utilidad de la microscopía electrónica de transmisión (TEM) en muestras de criobiopsia pulmonar transbronquial (TBLC) de 16 pacientes consecutivos sometidos a una evaluación de rutina de la enfermedad pulmonar intersticial fibrótica (EPI). Además del examen patológico de rutina, se prepararon de 1 a 2 muestras de TBLC para el análisis TEM y se evaluaron utilizando un Zeiss LEO EM 910. Las criobiopsias subpleurales y las biopsias por escisión no congeladas de tejido fresco de lobectomía de pacientes con cáncer de pulmón sin EPI sirvieron como controles. TEM proporcionó imágenes de alta calidad con solo crioartefactos menores en comparación con los controles. Además, en varios pacientes con EPI encontramos marcadas anomalías endoteliales microvasculares, como protrusiones luminales similares a pseudópodos y defectos de la superficie interna. Estos estaban ampliamente presentes en cuatro (25%), moderadamente presentes en siete (43,8%) y en gran medida ausentes en cinco (31,3%) pacientes. Un mayor grado de anomalías endoteliales de TEM se asoció con una edad más joven, un patrón de neumonía intersticial no específica, un mayor recuento de linfocitos del lavado broncoalveolar, autoanticuerpos positivos y una espirometría, capacidad de difusión y biomarcadores de oxigenación más bajos. Concluimos que la evaluación TEM de muestras TBLC de pacientes con EPI es factible, mientras que las alteraciones microvasculares observadas justifican una evaluación adicional.

Breve informe

El espectro de enfermedades pulmonares intersticiales fibróticas (EPI) comparte mecanismos patogénicos de inflamación y fibrosis que no sólo involucran el espacio intersticial, sino también el epitelio alveolar y el endotelio vascular.1, 2). Mientras que la microscopía óptica sólo permite una percepción limitada de tales procesos (3, 4), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) permite una visión más profunda de las estructuras celulares y subcelulares, y potencialmente puede visualizar alteraciones tempranas específicas de la enfermedad (5). La criobiopsia pulmonar transbronquial (TBLC) ha demostrado un equilibrio razonable entre la cantidad y la calidad del tejido recuperado y el riesgo del procedimiento, con un rendimiento diagnóstico similar a la biopsia pulmonar quirúrgica.6). Como las muestras de TBLC de pacientes con EPI fibrótica no han sido estudiadas sistemáticamente mediante TEM hasta el momento, evaluamos la viabilidad de este enfoque y, en particular, las alteraciones microvasculares en una cohorte de pacientes con EPI fibrótica consecutiva sometidos a una evaluación broncoscópica de rutina en el Hospital Universitario Kepler de Linz, Austria, en el año 2023.

Los pacientes con EPI fibrótica (es decir, con evidencia de tomografía computarizada de un patrón reticular, bronquiectasias por tracción o panal de abejas) brindaron su consentimiento informado por escrito para una evaluación TEM adicional de 1 a 2 muestras de TBLC, dado que había suficiente material de biopsia para el examen patológico de rutina. TBLC se realizó de acuerdo con el estado actual del arte (6), bajo anestesia general intravenosa con intubación broncoscópica rígida y ventilación jet. Se colocó un catéter con balón para el control del sangrado y se recuperaron un mínimo de 4 muestras de TBLC de dos segmentos pulmonares diferentes bajo control fluoroscópico. Las muestras para TEM se fijaron en una solución tamponada con cacodilato de glutaraldehído al 2,5% y paraformaldehído al 2%, se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1% y se incluyeron en resina epoxi. Se analizaron secciones ultrafinas en un Zeiss LEO EM 910. Las muestras de biopsia destinadas a microscopía óptica de rutina se fijaron en formalina al 4% y se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE). Para los controles, se tomaron muestras de tejido fresco de lobectomía subpleural de pacientes con cáncer de pulmón no afectados por EPI que participaron en otro estudio mediante una criosonda insertada a través de una incisión pleural y mediante escisión sin congelación.

De los 18 pacientes inscritos, una muestra para el análisis TEM no contenía suficiente tejido pulmonar alveolar y, en un paciente, la hemorragia endobronquial impidió que el investigador adquiriera una muestra adicional para TEM. En los 16 pacientes restantes, TEM reveló una buena preservación ultraestructural y permitió la definición de un conjunto estandarizable de crioartefactos en comparación con tres controles no congelados: el tejido criomuestreado se caracterizó predominantemente por espacios intersticiales expandidos y una densidad electrónica reducida de las áreas citoplasmáticas. Esto comúnmente iba acompañado de una inflación de los compartimentos membranosos, como los retículos endoplasmáticos, y de una inflamación mitocondrial junto con una pérdida de la estructura y coherencia de la membrana interna. (Higo. 1C.A).

Figura 1

Imágenes representativas de capilares alveolares y tejido circundante en un control no congelado. (a)un control congelado en una criosonda (b)y una muestra de criobiopsia de un caso de EPI (do). En las muestras de criobiopsia, las mitocondrias (flechas) están dilatadas y carecen de estructura de membrana interna, el retículo endoplasmático (puntas de flecha blancas) y otros compartimentos membranosos parecen hinchados. Algunos espacios intersticiales están dilatados (asteriscos). bl: lámina basal, cf.: fibrillas de colágeno, ef: fibras elásticas, E: célula endotelial, Er: eritrocito, F: fibroblasto, P1: neumocito tipo 1, flechas: mitocondrias, puntas de flecha blancas: retículo endoplásmico, asterisco: espacios dilatados. Barras de escala: 1 μm

Imagen a tamaño completoFigura 2

Imágenes representativas de capilares alveolares y tejido circundante que muestran diferentes grados de alteraciones endoteliales de TEM. En muestras de primer grado. (a, b) Las células endoteliales capilares muestran una morfología normal y aplanada, en grado 2. (cd) están parcialmente engrosados ​​y forman protuberancias seudopodiales luminales (puntas de flecha negras). Esto aumenta aún más en número y tamaño en el tercer grado. (mi, f)hasta completar la obturación del vaso (F). bl: lámina basal, cf.: fibrillas de colágeno, ef: fibras elásticas, E: célula endotelial, Er: eritrocito, F: fibroblasto, P1: neumocito tipo 1, puntas de flecha negras: protuberancias endoteliales. Barras de escala: 1 μm

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En comparación con los controles, el parénquima alveolar de los pulmones con EPI se caracterizó por mayores depósitos de colágeno, fibras elásticas y presencia de fibroblastos (Fig. 2cfr). En varios casos, las capas de la membrana basal entre los endotelios capilares y los neumocitos estaban engrosadas, intercaladas con fibras de colágeno y protrusiones de fibroblastos (Figs. 1c y 2d).

Los hallazgos más evidentes de la TEM relacionados con la morfología microvascular en una fracción considerable de pacientes fueron una marcada transformación de los endotelios capilares hacia una forma de células engrosadas en comparación con su apariencia escamosa normal, y la presencia de numerosos pseudópodos que sobresalen hacia la luz. Los engrosamientos endoteliales, ya sea en forma de cojín o a lo largo de todo el perímetro, junto con los pseudópodos, conducen incluso en casos extremos a una obstrucción capilar completa (fig. 2cfr). Estas anomalías endoteliales se clasificaron como grado 3 (muy presente) en 4 pacientes (25%), como grado 2 (moderadamente presente) en 7 pacientes (43,8%) y como grado 1 (muy ausente) en 5 pacientes (31,3%). . (Higo. 2)

Aunque menos distintivas que en TEM, la microscopía óptica de rutina también reveló características vasculares patológicas en varios pacientes, incluyendo hinchazón y mayor número de células endoteliales y proliferación de vasos focales. De manera análoga, clasificados por gravedad, estos se correlacionaron con las alteraciones endoteliales detectadas en TEM (Tabla 1).

Tabla 1 Características basales de los pacientes, resultados de laboratorio, función pulmonar y microscopía óptica de todos los pacientes, y según grados de alteraciones endoteliales de TEMmesa de tamaño completo

Como se muestra en la tabla 1los pacientes con alteraciones endoteliales más avanzadas eran más jóvenes, más hipoxémicos y tenían menores volúmenes pulmonares y capacidad de difusión. Radiológicamente, exhibieron con mayor frecuencia un patrón de neumonía intersticial no específica (NSIP), tuvieron un mayor recuento de linfocitos en el lavado broncoalveolar (BAL) y cumplieron con mayor frecuencia el dominio serológico de neumonía intersticial con características autoinmunes. Sin embargo, los pacientes de grado 3 no mostraron otros signos clásicos de inflamación aguda, ni localmente, como agregados de linfocitos y presencia de folículos linfáticos en microscopía óptica, ni sistémicamente, como elevaciones de biomarcadores sanguíneos relevantes como PCR y LDH (Tabla 1).

Nuestros resultados demuestran que el examen diagnóstico por TEM de muestras de TBLC de pacientes con EPI es factible y permite obtener imágenes ultraestructurales de alta calidad, con crioartefactos que se producen de forma estandarizada. Principalmente, esto implica que nuestro enfoque descrito puede considerarse como un método para futuras investigaciones de la EPI fibrótica, especialmente en lo que respecta a los procesos microvasculares. El número de pacientes de nuestro estudio fue reducido, por lo que no se pueden extraer conclusiones definitivas sobre el origen y significado de las alteraciones vasculares detectadas. Aún así, nuestros hallazgos de marcadas anomalías endoteliales en un subgrupo de pacientes con EPI enfatizan una vez más el papel prominente del endotelio pulmonar en los procesos fisiopatológicos subyacentes a la EPI fibrótica.2).

Aunque los pacientes con alteraciones endoteliales de TEM en etapa 3 tenían un mayor recuento de linfocitos en el BAL, presencia de autoanticuerpos y un patrón radiológico NSIP en la mayoría de los casos, exhibieron signos de inflamación mediante microscopía óptica bastante menos pronunciados y niveles discretos de biomarcadores de inflamación sistémica relevantes. Tal discrepancia entre la transformación endotelial avanzada y la ausencia de inflamación local completamente desarrollada puede correlacionarse indirectamente con los resultados de un estudio post mortem sobre neumonía fatal por COVID-19, donde la TEM no logró revelar anomalías endoteliales significativas a pesar de la evidencia de daño epitelial alveolar severo.7).

Es interesante destacar que se ha informado de una formación de pseudópodos endoteliales luminales similares a la observada en nuestra cohorte como respuesta a la falta de flujo de líquido capilar en los músculos esqueléticos de ratas.8), por lo que las alteraciones capilares observadas podrían representar una respuesta a las condiciones alteradas del flujo sanguíneo y al esfuerzo cortante en las áreas pulmonares afectadas por la EPI.

La investigación sobre la esclerosis sistémica y la hipertensión arterial pulmonar implica que la remodelación microvascular también podría ser indicativa de una transición endotelial a mesenquimal.9, 10). Alternativamente, como los pacientes en etapa TEM 3 en el presente estudio tenían espirometría, capacidad de difusión y oxigenación más bajas…