Resumen
Fondo
Se han definido dos subconjuntos de células B opuestos en función de su perfil de citoquinas: células B efectoras productoras de IL-6 (B-effs) versus células B reguladoras productoras de IL-10 (B-regs) que respectivamente regulan positiva o negativamente las respuestas inmunitarias. Los B-regs están disminuidos y/o deteriorados en muchas enfermedades autoinmunes y condiciones inflamatorias. Dado que cada vez hay más pruebas que relacionan las células B y los folículos linfoides ricos en células B con la patogenia de la EPOC, el objetivo de este estudio fue investigar la presencia y la función de las B-regs en la EPOC.
Métodos
En primer lugar, se determinó mediante inmunohistoquímica la presencia de células B reguladoras productoras de IL-10 en tejido pulmonar humano. En segundo lugar, la cuantificación de IL-10 + B-regs e IL-6 + B-effs en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de controles sanos, fumadores sin limitación del flujo de aire y pacientes con EPOC (estadio GOLD I-IV) se realizó por flujo. citometría En tercer lugar, expusimos las células B derivadas de la sangre de pacientes con EPOC in vitro al extracto de humo de cigarrillo (CSE) y cuantificamos IL-10 + B-regs e IL-6 + B-effs. Además, nuestro objetivo era restaurar la producción perturbada de IL10 bloqueando BAFF. En cuarto lugar, determinamos la expresión de ARNm de los factores de transcripción involucrados en la producción de IL-10 en células B ingenuas y de memoria ordenadas por FACS tras la exposición al medio o CSE.
Resultados
La presencia de células B reguladoras productoras de IL-10 en parénquima y folículos linfoides en pulmones fue confirmada por inmunohistoquímica. El porcentaje de IL-10 + B-regs se redujo significativamente en los subconjuntos de células B de memoria derivadas de la sangre de fumadores sin limitación del flujo de aire y pacientes con EPOC, en comparación con los que nunca fumaron. Además, la capacidad de las células B para producir IL-10 se redujo tras la exposición in vitro a CSE y esto no pudo restaurarse mediante el bloqueo de BAFF. Finalmente, tras la exposición a CSE, los niveles de ARNm de los factores de transcripción IRF4 y HIF-1α disminuyeron en las células B de memoria.
Conclusión
La disminución del número y el deterioro de la función de B-regs en fumadores y pacientes con EPOC podrían contribuir al inicio y la progresión de la enfermedad.
Introducción
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad inflamatoria caracterizada por una limitación irreversible del flujo de aire debido a bronquiolitis obstructiva, enfisema e inflamación pulmonar crónica. [1]. Es la tercera causa de muerte en el mundo [2] y se estima que el 10% de los adultos mayores de 40 años viven actualmente con EPOC [3]. La EPOC resulta de la exposición a largo plazo a gases y partículas nocivos, combinados con factores individuales que incluyen la susceptibilidad genética, la nutrición y el envejecimiento. El principal factor etiológico es el tabaquismo, pero también se identificaron como factores de riesgo importantes la contaminación del aire interior y los polvos, humos y productos químicos ocupacionales. [2].
Aunque rara vez se encuentran en pulmones sanos, la presencia de células B en los pulmones está asociada con infecciones y afecciones inflamatorias crónicas como la EPOC. [4]. Se han encontrado autoanticuerpos en pacientes con EPOC [5] y las etapas graves de la enfermedad se caracterizan por un aumento en el número de células B y folículos linfoides ricos en células B alrededor de las vías respiratorias pequeñas. [6, 7]. Además, se ha demostrado que los niveles de la quimiocina CXCL13 que atrae a las células B y el factor BAFF de supervivencia/maduración de las células B aumentan en los pulmones de pacientes con EPOC. [8, 9]. Por lo tanto, se considera que las células B disfuncionales y sus productos desempeñan un papel patogénico en la EPOC.
Más allá de su función como células productoras de anticuerpos, se han atribuido a las células B otras funciones importantes, como la presentación de antígenos y la producción de citoquinas. Según su perfil de producción de citocinas, se han definido dos conjuntos opuestos de células B: células B efectoras (B-effs) que regulan positivamente las respuestas inmunitarias mediante la liberación de citocinas proinflamatorias como la interleucina (IL)-6, IFN-γ y GM-CSF versus células B reguladoras (B-regs) que regulan negativamente las respuestas inmunitarias a través de la liberación de citocinas antiinflamatorias como IL-10, IL-35 y factor de crecimiento transformante (TGF)-β [10]. Los B-regs funcionan como un mecanismo de retroalimentación que mantiene el equilibrio inmunitario al prevenir la inflamación excesiva y el daño tisular. Se han observado B-regs disminuidos o deteriorados en muchas enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas y cánceres que conducen a un desequilibrio inmunológico. [10,11,12,13].
La IL-10 derivada de células B es el sello distintivo para la identificación de B-regs en ratones y humanos. [14, 15]. La IL-10 derivada de B-reg es responsable de la conversión de células T CD4+ en células T reguladoras (Tregs), la inhibición de la diferenciación Th1/Th17, la inhibición de la producción de TNF-α por monocitos y el mantenimiento de células asesinas naturales invariantes (iNKT) [16]. En este estudio, definimos subconjuntos de células B con capacidades reguladoras a través de la producción de IL-10 como IL10 + B-regs. El enfoque de la inhibición de BAFF para restaurar el desequilibrio B-reg/B-eff no se ha explorado para la EPOC y podría valer la pena explorarlo ya que se ha propuesto la expansión local de B-regs en el pulmón. [16]. La investigación sobre los factores de transcripción implicados en la producción de IL-10 no es concluyente [12]pero la subunidad alfa del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1α) [17] y factor regulador de interferón 4 (IRF4) [18] han sido identificados como promotores de la producción de IL-10.
El objetivo de esta investigación fue estudiar las células B reguladoras y efectoras en la EPOC para proporcionar una base científica para terapias potenciales dirigidas a las células B en la EPOC. Primero, verificamos la presencia de B-regs productores de IL-10 en tejido pulmonar humano. En segundo lugar, cuantificamos los B-regs productores de IL-10 y los B-effs productores de IL-6 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de controles sanos, fumadores sin limitación del flujo de aire y pacientes con EPOC. En tercer lugar, expusimos células B de pacientes con EPOC in vitro a CSE y cuantificamos B-regs productores de IL-10 y B-effs productores de IL-6. A continuación, bloqueamos BAFF en estas células B expuestas a CSE in vitro con el objetivo de restaurar la producción de IL-10. En cuarto lugar, cuantificamos los niveles de ARNm de los factores de transcripción IRF4 y HIF-1α en células B ingenuas y de memoria expuestas a medio o CSE.
Diseño y métodos de investigación
Los datos se informan de acuerdo con la lista de verificación STROBE para estudios transversales [19, 20].
Tinción inmunohistoquímica para IL-10 y CD20 en tejido pulmonar humano
Muestras de tejido pulmonar humano para IHC
La tinción inmunohistoquímica (IHC) se realizó en muestras de resección pulmonar obtenidas de 5 pacientes en el Hospital Universitario de Gante (Bélgica). Las características del paciente del sujeto inscrito se pueden encontrar en Archivo adicional 1: Tabla S1. El tejido pulmonar se derivó de pacientes diagnosticados con tumores pulmonares solitarios a la máxima distancia de las lesiones pulmonares y sin signos de neumonía retroobstructiva o invasión tumoral. Ninguno de los pacientes quirúrgicos fue tratado con quimioterapia neoadyuvante. Todas las muestras fueron recolectadas entre 2002 y 2020 de manera no probabilística. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Este estudio fue aprobado por el comité de ética médica del Hospital Universitario de Gante (2011/0114; 2016/0132; 2019/0537).
Procedimiento de tinción IHC
Las secciones de tejido pulmonar embebidas en parafina primero se sometieron a recuperación de antígeno con tampón de citrato (Scytek), seguido de incubación con anticuerpo anti-IL10 durante 24 h. A continuación, los portaobjetos se colorearon con anticuerpo secundario anti-rata burro conjugado AF488 durante 2 h. Luego, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-CD20 humano de ratón durante 2 h, seguido de coloración con anticuerpo secundario de burro-anti-ratón conjugado con AF647 y DAPI. Se usaron controles de isotipo apropiados durante el procedimiento de tinción para probar interacciones no específicas. Los anticuerpos utilizados para la inmunohistoquímica se pueden encontrar en Archivo adicional 1: Tabla S2.
Cuantificación de subconjuntos de células B y células B productoras de IL-6 e IL-10 en la sangre
Población de estudio
Las características de los sujetos (n = 30) que se incluyeron en el aislamiento de PBMC se presentan en la Tabla 1. Las muestras de 5 pacientes con EPOC utilizadas para la purificación de células B después del aislamiento de PBMC utilizadas durante el experimento de exposición a CSE in vitro…
