Resumen
Antecedentes
En los últimos años, los cigarrillos electrónicos se han utilizado como alternativa entre los fumadores adultos. Sin embargo, el impacto del uso de cigarrillos electrónicos en las células epiteliales bronquiales humanas (HBE) sigue siendo controvertido.
Métodos
Recolectamos células HBE primarias de no fumadores sanos y fumadores con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), y analizamos el impacto del extracto de vapor de cigarrillo electrónico (ECE) o del extracto de humo de cigarrillo (CSE) en la diferenciación y lesión de las células HBE mediante secuenciación de ARN unicelular. , inmunotinción, tinción HE, qPCR y ELISA. Obtuvimos suero y esputo de no fumadores, fumadores y usuarios de cigarrillos electrónicos sanos, y analizamos marcadores de lesión celular y proteínas mucina.
Resultados
El tratamiento con ECE condujo a un programa distinto de diferenciación de células ciliadas y patrones únicos de sus comunicaciones entre células en comparación con el CSE. El tratamiento con ECE provocó un aumento de la intensidad de la señalización de Notch en una subpoblación de células ciliadas, y remodelación y lesión de las células HBE, incluida hipoplasia de células ciliadas y células club, y cilios más cortos. La hipoplasia de células ciliadas y cilios más cortos inducida por ECE mejoró mediante la inhibición de la señalización de Notch.
Conclusiones
Este estudio revela características distintas en la remodelación epitelial de las vías respiratorias inducida por el vapor del cigarrillo electrónico, lo que apunta a la vía de señalización de Notch como una posible intervención dirigida para los defectos de diferenciación de las células ciliadas y la lesión de los cilios causados por el vapor del cigarrillo electrónico. Además, una disminución de las proteínas SCGB1A1 se asocia con los usuarios de cigarrillos electrónicos, lo que indica un posible marcador de lesión pulmonar para los usuarios de cigarrillos electrónicos.
Introducción
El epitelio de las vías respiratorias, compuesto por células basales, células multiciliadas, células club, células caliciformes y varios tipos de células raras, es el sitio principal de enfermedades pulmonares, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la tercera causa de muerte en el mundo para 2030 según a la predicción de la OMS (https://www.emro.who.int/health-topics/chronic-obtaining-pulmonary-disease-copd/index.html). El tabaquismo puede causar remodelación epitelial de las vías respiratorias, incluida hipoplasia de células multiciliadas, hiperplasia de células caliciformes y sobreproducción de moco, y es la principal causa de EPOC.
En los últimos años, los cigarrillos electrónicos se han utilizado como alternativa entre los fumadores adultos. Sin embargo, la comercialización no regulada de los cigarrillos electrónicos conduce a una mayor prevalencia del tabaquismo en los niños y a una edad inicial más baja de inicio del tabaquismo. Los estudios sobre los efectos pulmonares del uso de cigarrillos electrónicos se han centrado en la respuesta inflamatoria, la integridad de la barrera epitelial y los cambios fisiológicos. Se ha demostrado que los usuarios de cigarrillos electrónicos exhiben un perfil alterado de proteínas inmunes innatas, un desequilibrio proteasa-antiproteasa y/o una mayor producción de MUC5AC pero no de MUC5B.1,2,3). El vapor del cigarrillo electrónico altera la función mucociliar de las vías respiratorias, la función pulmonar y la destrucción del tejido pulmonar, y también altera la homeostasis de los lípidos pulmonares en animales de experimentación.4,5,6). Además, el uso de cigarrillos electrónicos también aumenta la presión arterial, la rigidez aórtica y la frecuencia cardíaca (7).
Varios estudios transcriptómicos en masa revelan que el uso de cigarrillos electrónicos o la exposición al vapor altera los perfiles de expresión genética en las células o tejidos respiratorios. Por ejemplo, la exposición de cultivos de células epiteliales bronquiales humanas diferenciadas (HBE) al vapor de los cigarrillos electrónicos conduce a patrones de expresión genética alterados en las vías del metabolismo de los fosfolípidos y triacilgliceroles de ácidos grasos, genes inflamatorios, genes de proteínas ribosómicas y genes relacionados con los cilios.8,9,10). La exposición de las células HBE a sustancias químicas aromatizantes como el diacetilo y la 2,3-pentanodiona que se encuentran en los cigarrillos electrónicos también puede disminuir la expresión de genes relacionados con la ciliogénesis y conduce a una reducción del número de células ciliadas.11). Estos datos sugieren que la exposición a los cigarrillos electrónicos puede afectar la función de los cilios y/o la formación de la estructura de los cilios. Además, las biopsias de raspado nasal de usuarios de cigarrillos electrónicos muestran una disminución de la expresión de ARN de genes relacionados con el sistema inmunológico (12). Sin embargo, aún no está claro cómo el cigarrillo electrónico afecta en detalle a las células epiteliales de las vías respiratorias humanas, especialmente a la diferenciación del subtipo de células ciliadas y la estructura de los cilios, incluida la longitud de los cilios.
Aquí, investigamos los efectos potenciales del extracto de vapor de cigarrillos electrónicos (ECE) en las células HBE de no fumadores sanos y fumadores con EPOC. Como referencia, también examinamos los efectos del extracto de humo de cigarrillo (CSE). Expusimos células HBE cultivadas in vitro en una interfaz aire-líquido (ALI) a ECE o CSE con una concentración igual de nicotina. Para superar las limitaciones de los análisis de tejido en masa, utilizamos tecnología de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-Seq) para perfilar los transcriptomas de células HBE individuales en cultivos ALI. También caracterizamos los efectos de ECE o CSE en células HBE mediante el uso de inmunotinción, tinción HE, qPCR y ELISA. Estos resultados revelan una remodelación y lesión distinta de las células ciliadas bronquiales causadas por ECE en no fumadores sanos y pacientes con EPOC, e indican una posible intervención terapéutica de la remodelación epitelial de las vías respiratorias y la lesión causada por el vapor del cigarrillo electrónico al inhibir la señalización de Notch.
Métodos
Colección de cepillado bronquial humano.
Las células primarias del epitelio bronquial humano (HBE) (material obtenido del Biobanco del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou, Guangzhou, China, y aprobado por el comité de ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou 2020-51) se obtuvieron a partir de cepillados. de bronquiolos de orden 5 a 6 tomados durante una broncoscopia con fibra óptica con un citocepillo endoscópico. La EPOC se confirmó mediante FEV1/FVC posbroncodilatador < 70%. Los estadios de la EPOC se clasificaron mediante clasificación espirométrica (GOLD III: 30 % ≤ FEV1 < 50 % del previsto, GOLD IV: FEV1 < 30 % del previsto). Se excluyeron de este estudio los pacientes con asma, bronquiectasias, fibrosis pulmonar o infección. Esta información sobre no fumadores sanos y fumadores con EPOC se incluye en la Tabla complementaria 1 (Tabla S1).
Aprobación ética
Este estudio se lleva a cabo de acuerdo con las pautas éticas descritas en la Declaración de Helsinki. Este estudio ha sido aprobado por la junta de revisión institucional del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou. Se obtuvieron consentimientos informados por escrito de todos los participantes que aceptaron participar en este estudio.
Cigarrillos electrónicos y cigarrillos.
El sistema de cigarrillo electrónico, que incluye un dispositivo RELX Wuxian y una cápsula con líquido electrónico con sabor a mentol, estaba disponible comercialmente en el momento del estudio y se obtuvo en una tienda minorista en Shenzhen, China. La formulación principal de e-líquido que contiene mentol incluye principalmente propilenglicol (PG) (35%), glicerol (51%), nicitona (4%) y sabores (10%). La potencia del dispositivo RELX Wuxian fue de 6,5 vatios. Se obtuvo un cigarrillo combustible comercial (Hongmei, Hongta Group, China) en una tienda minorista en Guangzhou, China. Ambos se almacenaron en un recipiente hermético a temperatura ambiente hasta su uso.
Preparación CSE y ECE
Se prepararon extractos acuosos del vapor del cigarrillo electrónico y del humo del cigarrillo (CS) que contienen mentol con los siguientes métodos. Se utilizó una máquina para fumar Cerulean CETI 8 MK3 (CERULEAN, Reino Unido) para generar vapor de cigarrillo electrónico y CS convencional. El vapor de los cigarrillos electrónicos y el CS se generaron según la cooperación.
Centro de Investigaciones Científicas Relativas al Tabaco (CORESTA) Método recomendado No. 81, régimen de vapeo (que especifica un perfil de calada de onda cuadrada, volumen de calada de 55 ml, duración de 3 s y un intervalo de 30 s) y método ISO 20778:2018 (que especifica un 55 Volumen de inhalación de ml, duración de 2 s y un intervalo de 30 s), respectivamente. El vapor o humo principal se pasó a través de los dos recipientes de recolección con 2 x 20 ml de medio DMEM/F-12 y luego se mezcló y agitó durante 20 minutos para obtener los extractos acuosos de vapor de cigarrillo electrónico y CS para su uso. La concentración de nicotina se determinó mediante UPLC (Waters, EE. UU.).
Medición de componentes en CSE y ECE.
Los componentes principales del humo de los cigarrillos electrónicos y de los cigarrillos recogidos en los extractos del medio de cultivo también se analizaron mediante cromatografía de gases-espectroscopia de masas (GC-MS), y los resultados mostraron que había diferencias significativas en los componentes principales de los dos extractos. (Tabla S2). El componente común era la nicotina con un contenido de 1304,9 (ECE) y 1022,7 (CSE) mg/kg, respectivamente (Tabla S2). Los otros componentes principales del vapor del cigarrillo electrónico recolectados en el medio de cultivo incluyeron PG, Gly, mentol racémico y alcohol etílico, que eran básicamente los mismos que los ingredientes principales del líquido del cigarrillo electrónico, a excepción del ácido benzoico por debajo del límite de detección ( Tabla S2). Otros componentes importantes por debajo del límite de detección incluyeron ácido acético, acetona alcohol, dihidroxiacetona, etc., que solo pueden identificarse cualitativamente mediante GC-MS debido a su bajo contenido. Los otros componentes característicos principales del humo del cigarrillo recogidos en el medio de cultivo fueron el triacetato de glicerol y otros ingredientes relativamente ricos, como acetona, acetato de metilo, 2-butanona, ácido acético, 1,3-dihidroxiacetona, fenol, glicérido de ácido acético, etc. . Los valores de pH de CSE o ECE con una concentración igual de nicotina de 0,02 mg/ml utilizados para la exposición a células HBE en este estudio son 7,66 y 7,74, respectivamente.
Cultivo ALI de células HBE y CES, ECE o tratamiento químico
Las células HBE se cultivaron en condiciones de interfaz aire-líquido para formar cultivos pseudoestratificados bien diferenciados como se describió anteriormente (25). Brevemente, las células HBE aisladas se mantuvieron y expandieron (un pase) en matraces T75 en medio de expansión de células epiteliales bronquiales (05040, STEMCELL Technologies) a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. Con una confluencia del 80%, las células se separaron con tripsina-EDTA al 0,05% (Gibco) y se sembraron en soportes de membrana (insertos de cultivo Transwell de 12 mm, tamaño de poro de 0,4 µm, Costar) recubiertos con 0,05 mg de colágeno de piel de ternero (Sigma-Aldrich) en AEGM listo para usar suplementado con penicilina/estreptomicina al 1%. Las células HBE se cultivaron durante dos días hasta que alcanzaron una confluencia completa. Luego se eliminó el medio apical y el medio basal se…
