La regulación negativa de la alteración metabólica lipídica de AECII mediada por HMGCS2 promueve la fibrosis pulmonar mediante la activación de los fibroblastos

Resumen

Antecedentes

Recientemente se ha informado que el metabolismo anormal de los lípidos es una característica crucial de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI). Sin embargo, el origen y la función biológica de los lípidos y los posibles mecanismos del aumento del contenido de lípidos en la patogénesis de la FPI siguen sin determinarse.

Métodos

Se utilizaron tinción con aceite rojo y análisis de inmunofluorescencia para detectar la acumulación de lípidos en secciones congeladas de fibrosis pulmonar de ratón, células epiteliales alveolares humanas tipo II (AECII) tratadas con bleomicina y fibroblastos de pulmón. Se aplicó un análisis ómico de lípidos no dirigido para investigar especies diferenciales de lípidos y se identificó que LysoPC se utilizó para tratar fibroblastos de pulmón humanos y ratones. Los conjuntos de datos de expresión de ARN unicelular y de microarrays identificaron genes expresados ​​diferencialmente relacionados con el metabolismo de los lípidos. El experimento de ganancia de función se utilizó para estudiar la función de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-Coa sintasa 2 (HMGCS2) en la regulación del metabolismo de los lípidos de AECII. Ratones con AECII-HMGCS2 alto se establecieron mediante la administración intratraqueal del virus adenoasociado HBAAV2/6-SFTPC-HMGCS2. Se utilizaron transferencias Western, coinmunoprecipitación, inmunofluorescencia, mutación dirigida al sitio y citometría de flujo para investigar los mecanismos del metabolismo lipídico mediado por HMGCS2 en AECII.

Resultados

Los AECII lesionados fueron la principal fuente de lípidos acumulados en respuesta a la estimulación con bleomicina. Los LysoPC liberados por los AECII lesionados podrían activar los fibroblastos pulmonares, promoviendo así la progresión de la fibrosis pulmonar. Mecánicamente, HMGCS2 disminuyó explícitamente en AECII y la expresión ectópica de HMGCS2 en AECII utilizando el sistema AAV alivió significativamente la progresión de la fibrosis pulmonar experimental en ratones mediante la modulación de la degradación de lípidos en AECII mediante la promoción de la expresión de CPT1A y CPT2 al interactuar con PPARα.

Conclusiones

Estos datos revelaron un nuevo mecanismo etiológico del metabolismo de los lípidos AECII mediado por HMGCS2 en la génesis y el desarrollo de la fibrosis pulmonar y proporcionaron un nuevo objetivo para la intervención clínica.

Fondo

La fibrosis pulmonar (FP) constituye la etapa final de una amplia gama de enfermedades pulmonares intersticiales heterogéneas, caracterizadas por la destrucción del parénquima pulmonar, el depósito de matriz extracelular y cambios dramáticos en el fenotipo tanto de los fibroblastos como de las células epiteliales alveolares.1, 2). La fibrosis pulmonar idiopática (FPI), la forma más común y mejor caracterizada de fibrosis pulmonar, es una enfermedad letal con una supervivencia media de 3 a 5 años tras el diagnóstico.3, 4). Los datos más recientes muestran que de 2004 a 2017, el número de muertes de pacientes hospitalizados por FPI en los Estados Unidos siguió aumentando (5). El último estudio encontró que la incidencia ajustada de la FPI (0,35-1,30 por 10.000 personas) y la prevalencia ajustada de la FPI (0,57-4,51) eran ambas mayores en la región de Asia y el Pacífico que en el resto del mundo (6), a pesar de los extensos esfuerzos de investigación y dos medicamentos aprobados por la FDA, sigue siendo una carga para la salud significativa y una necesidad terapéutica insatisfecha (2). Actualmente, no existe cura para la PF excepto el trasplante de pulmón; por lo tanto, revelar los potenciales factores patogénicos y posibles mecanismos contribuiría a la prevención y tratamiento de esta enfermedad mortal.

El paradigma actual de la FPI propone ciclos repetidos de lesión de las células epiteliales alveolares del pulmón, estimulando el reclutamiento y la activación de células fibrogénicas del tejido, lo que conduce a fibrosis e insuficiencia orgánica terminal. Estudios recientes demostraron que la desregulación del metabolismo era una característica clave de la FPI (7,8,9), y los estudios clínicos demostraron que se detectaron lípidos anormales en el suero y en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) tanto en pacientes con FPI como en modelos experimentales de ratones (10,11,12). Sin embargo, el origen de los lípidos seguía siendo desconocido y la función biológica y los posibles mecanismos del aumento de lípidos en el proceso de la FPI aún estaban indeterminados.

En el estudio actual, estudiamos los efectos y mecanismos de la acumulación anormal de lípidos en la FPI. Nuestros datos mostraron que los AECII dañados eran la principal fuente de lípidos acumulados en respuesta a la estimulación con bleomicina. Además, demostramos que las LysoPC liberadas por AECII lesionadas podrían activar los fibroblastos pulmonares in vitro y promover la progresión de la fibrosis pulmonar in vivo. Además, confirmamos que HMGCS2 desempeñó un papel vital en la mitigación de la progresión fibrótica pulmonar mediante la modulación de la degradación de lípidos en AECII mediante la promoción de la expresión de CPT1A y CPT2 al interactuar con PPARα.

En resumen, este estudio reveló un nuevo mecanismo etiológico de la fibrosis pulmonar y proporcionó un nuevo objetivo para la intervención clínica.

Métodos

Muestras de tejido y suero de pacientes con FPI.

El diagnóstico de FPI se basó en las Guías de práctica clínica ATS/ERS/JRS/ALAT. Las muestras de tejido de FPI eran restos quirúrgicos de biopsias de pacientes sometidos a trasplantes pulmonares en el Hospital Provincial de Tórax de Henna. También se recogieron muestras de suero de FPI y de voluntarios sanos en el Hospital Provincial de Tórax de Henna. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación Médica del Hospital Provincial de Tórax de Henan.

Línea celular y cultivo.

La línea celular epitelial de tipo alveolar humano tipo II A549 (13, 14) y los fibroblastos de pulmón humano IMR-90 se adquirieron en el Banco de Células de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Todas las células se cultivaron en el medio correspondiente (recomendado por los proveedores) suplementado con suero bovino fetal al 10% y se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con 5% de CO.2.

Ensayo de hidroxiprolina

La hidroxiprolina pulmonar se analizó con un kit de ensayo colorimétrico de hidroxiprolina (MAK008, Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante, como describimos anteriormente (15, dieciséis). Los datos se expresan como µg de hidroxiprolina/pulmón derecho.

Preparación de sobrenadante de cultivo celular y tratamiento con fibroblastos de pulmón.

Las células A549 se trataron con belomicina (20 μM) durante 48 h, y el sobrenadante se recogió y se diluyó con medio de cultivo de fibroblastos de pulmón (1:1). Posteriormente, el medio diluido se sometió a tratamiento IMR-90 durante 24 h. Se recogieron células para el análisis de expresión de proteínas.

Análisis de transferencia Western (WB)

La transferencia Western se realizó como se describió anteriormente (dieciséis). Después de la incubación con el anticuerpo secundario, las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron anti-HMGCS2 (para WB) (1:2000; Abcam ab137043), anti-α-SMA (1:2000; Abcam, ab7817), anti-Collagen1 (1:1000; Cell Signaling Technology, #72026), anti-Fibronectina (1:2000; Cell Signaling Technology, #26836), anti-PPARα (1:1000; Affinity, AF5301), anti-CPT1A (1:1000; Affinity, AF5301), anti-CPT2 ( 1:1000; Affinity, AF5301) y anti-GAPDH (1:4000; Beyotime, China).

Análisis inmunohistoquímico (IHC)

El análisis IHC se realizó como describimos anteriormente (17). Brevemente, se incluyeron tejidos pulmonares de ratón en parafina, se seccionaron y se rehidrataron; Estos antígenos se recuperaron calentando en tampón relativo a 95 °C durante 10 minutos siguiendo las instrucciones del anticuerpo (anti-HMGCS2 (1:200; Abcam ab137043)). La peroxidasa endógena se neutralizó utilizando la solución bloqueadora de peroxidasa endógena. Posteriormente, las secciones de pulmón se incubaron con un anticuerpo primario a 4 °C durante la noche. Después de que los anticuerpos secundarios marcados con biotina se incubaran a 37 °C durante 30 minutos, las secciones de pulmón se revelaron con solución de trabajo DAB y luego se tiñeron con hematoxilina y se montaron con un medio de montaje.

Análisis de inmunofluorescencia (IF)

Para IF, se utilizaron anti-HMGCS2 (1:200; monoclonal de ratón, sc-393,256, Santa Cruz, EE. UU.) y anti-PPARα (1:100; policlonal de conejo, AF5301, Affinity Biosciences), y se describió el protocolo (15).

modelo de ratón

Se adquirieron ratones C57BL/6 hembras libres de patógenos de 8 semanas de edad de Charles River Experimental Animal Technology Co. Ltd. (China; número de licencia.

SCXK 2016–0006) y mantenido en el nivel de bioseguridad apropiado a temperatura y humedad constantes con un ciclo de luz de 12 h. El modelo de fibrosis pulmonar en ratones se estableció como informamos anteriormente (15). Brevemente, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 40% y luego se les administró por vía intratraqueal bleomicina (Hisun Pharmaceuticals Co. Ltd) 1,5 U/kg diluida en solución salina o solución salina únicamente (como control) utilizando un catéter 22G (GE Healthcare). Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Normal de Henan, China.

Tratamiento LysoPC de fibroblastos pulmonares y ratones.

Dos LysoPC disponibles comercialmente: LysoPC (16:0) HMDB0240262 (Número CAS 66757–27-5, Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadá) y LysoPC(14:0) HMDB0010379 (Número CAS 20559–16-4, APExBio, Houston, USA) se disolvieron en DMSO para preparar una solución madre. Para el tratamiento con fibroblastos de pulmón in vitro, se agregaron LysoPC al medio de cultivo con una concentración final de 40 μM y se mantuvieron durante 48 h. Para el En un estudio in vivo con ratones, el LysoPC(14:0) se administró por vía intratraqueal, como se mencionó anteriormente, a una dosis de 12,5 mg/kg de ratón.

Aislamiento de AECII primarios en ratones.

Los AECII de ratones se aislaron utilizando un protocolo modificado de un método descrito previamente (18). Brevemente, se perfundió el pulmón de los ratones con 20 ml de tampón de lavado (DPBS sin Ca2+ y magnesio2+ y EDTA 0,2 mM) y se instilan con 2 ml de tampón de digestión (1 mg/ml de elastasa y 100 unidades/ml de DNasa I) de la tráquea (sellados con 0,5 ml de agarosa de bajo punto de fusión (2% en DPBS)) y se digieren en un recipiente de 15 ml. tubo durante 45 min a temperatura ambiente. Luego, el pulmón se picó con un disociador MACS y se filtró sucesivamente a través de un filtro celular de 100, 70, 40, 20 μm seguido de una centrifugación en gradiente de Percoll (300 g, 20 min). Las células de la capa media se resuspendieron con medio de cultivo y se cultivaron en una placa previamente recubierta CD45/32/16 (Biolegend, EE. UU.) para eliminar las células inmunitarias. Utilizando este protocolo, se obtuvo una pureza superior al 90% de AECII.

Establecimiento de la línea celular estable HMGCS2.

Las células epiteliales de tipo alveolar humano tipo II A549 que expresaban establemente HMGCS2 se establecieron de acuerdo con lo descrito anteriormente (19). Brevemente, el vector PCDNA3.1 -EGFP-T2A -HMGCS2 se transfectó usando…

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