Abstracto
Antecedentes
La fibrosis de las vías respiratorias es una de las características patológicas del asma grave. Se sabe que el factor de crecimiento transformante (TGF)-β promueve la formación de la transición epitelial-mesenquimatosa y desempeña un papel en la progresión de la fibrosis tisular. El factor de red de comunicación celular 2 (CCN2) y la fibronectina (FN) son marcadores bien conocidos de EMT y fibrosis. Sin embargo, se desconoce si AREG está involucrado en la expresión de CCN2 y FN inducida por TGF-β en células epiteliales de pulmón humano.
Métodos
AREG y FN se analizaron mediante tinción de inmunofluorescencia en ratones expuestos a ovoalbúmina. La expresión de CCN2 y FN se evaluó en células epiteliales de pulmón humano (A459) después del tratamiento con TGF o AREG durante los tiempos indicados. El AREG secretado de las células A549 fue detectado por ELISA. La migración celular se observó mediante un ensayo de cicatrización de heridas. Se usó inmunoprecipitación de cromatina para detectar la unión de c-Jun al promotor CCN2.
Resultados
Expresión de AREG y FN colocalizada en tejidos pulmonares de ratones con asma inducida por ovoalbúmina mediante tinción de inmunofluorescencia. Además, TGF-β provocó la liberación de AREG de las células A549 al medio. Expresión de AREG regulada negativamente por ARNip de Smad3. AREG también estimuló la expresión de CCN2 y FN, la fosforilación de JNK y c-Jun y la migración celular en células A549. El ARN pequeño de interferencia (si) de AREG inhibió la expresión de CCN2, FN y la migración celular inducida por TGF-β. Además, la expresión de CCN2 y FN inducida por AREG fue inhibida por EGFR siRNA, un inhibidor de JNK (SP600125) y un inhibidor de la proteína activadora-1 (AP-1) (curcumina). El siRNA de EGFR atenuó la fosforilación de JNK y c-Jun inducida por AREG. Además, SP600125 reguló a la baja la fosforilación de c-Jun inducida por AREG.
Conclusión
Estos resultados sugirieron que AREG media la EMT inducida por TGF-β en células epiteliales de pulmón humano a través de la activación de EGFR/JNK/AP-1. Comprender el papel de AREG en la EMT podría fomentar el desarrollo de estrategias terapéuticas para la remodelación de las vías respiratorias en el asma grave.
Introducción
El asma afectó a unos 262 millones de personas y provocó 461.000 muertes en todo el mundo en 2019 [1]. La remodelación de las vías respiratorias, la inflamación y la fibrosis pulmonar son características patológicas comunes del asma grave [2, 3]. La fibrosis pulmonar da como resultado la proliferación de fibroblastos, el depósito de matriz extracelular (ECM) (p. ej., fibronectina (FN) y colágeno) y la transición alveolar epitelial-mesenquimatosa (EMT) [4]. Además, el factor de crecimiento transformante (TGF)-β es una citocina bien conocida en el proceso de inflamación y remodelación de las vías respiratorias, así como en la EMT. [4, 5]. Sin embargo, existen pocas estrategias terapéuticas para la EMT alveolar en el asma grave.
La anfirregulina (AREG) es una proteína de membrana que es miembro de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Además, AREG puede ser proteolizado por una desintegrina y metaloproteasa 17 (ADAM17), lo que da como resultado una forma soluble del ligando. [6,7,8]. El AREG soluble actúa como ligando del receptor EGF (EGFR) y es responsable de la supervivencia, el crecimiento y la migración celular. [7, 9]. Estudios previos demostraron que AREG participa en la inflamación y lesión en diferentes tejidos como los pulmones, el hígado y los intestinos [10,11,12]. Se descubrió que AREG conduce a la proliferación de células epiteliales de las vías respiratorias y células del músculo liso de las vías respiratorias a través de la activación de EGFR, lo que afecta la remodelación de las vías respiratorias en el asma grave. [13, 14].
EMT es un proceso de transición de células epiteliales a células mesenquimales en lesiones tisulares que conduce a fibrosis de órganos [15]. Las células mesenquimales similares a fibroblastos pueden expresar FN, colágenos y α-actina de músculo liso (α-SMA) como marcadores de EMT [15, 16]. Estudios previos han demostrado que el TGF-β puede inducir EMT al activar el SMAD 2/3 clásico o una vía de señalización no clásica. [17, 18]. La creciente evidencia ha revelado que la EMT de las células epiteliales alveolares se puede observar en la fibrosis pulmonar. [4, 15]. Sin embargo, aún se desconoce el papel de AREG en la EMT de los tejidos alveolares.
El factor 2 de la red de comunicación celular (CCN2), un marcador fibrótico, es un mediador bien conocido de la remodelación de tejidos y la fibrosis. [19]. Numerosos estudios han informado que el aumento de CCN2 puede inducir el depósito de MEC, la diferenciación de miofibroblastos y la EMT. [20,21,22]. Se ha demostrado que la expresión de CCN2 aumenta con varios estimuladores, como TGF-β, hipoxia y factor de crecimiento endotelial vascular en fibroblastos pulmonares. [19, 21, 23]. Por lo tanto, CCN2 juega un papel crucial durante la fibrosis tisular o EMT. No obstante, aún no se ha identificado el mecanismo de expresión de CCN2 inducida por AREG.
La proteína activadora (AP)-1, un complejo c-Jun/c-Fos, es un factor de transcripción aguas abajo de la quinasa N-terminal (JNK) c-Jun. La vía JNK/AP-1 participa en la regulación de la proliferación, diferenciación, supervivencia y apoptosis celular. [24, 25]. Nuestro estudio anterior mostró que JNK y AP-1 participan en la fibrosis pulmonar [21]. Además, AREG puede activar la fosforilación de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) en la proliferación anormal de células lisas vasculares. [26]. Sin embargo, es necesario identificar si JNK/AP-1 media la EMT inducida por AREG.
En este estudio, encontramos que AREG y FN se coexpresaron en los tejidos pulmonares de ratones asmáticos. Además, AERG indujo la expresión de CCN2 en células A549 a través de la vía EGFR/JNK/AP-1.
materiales y métodos
Materiales
El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F-12 (12 500 062), el medio Opti (31 985 070) y el antibiótico-antimicótico (100 ×) (15 240 062) se compraron de GIBCO (Waltham, MA, EE. UU.). Controle el ARN pequeño de interferencia (si) (codificado), el ARNip de AREG, el ARNip de EGFR, el ARNip de Smad3, el suero bovino fetal (FBS) (F2442), un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) AREG humano (RAB0019) y un El anticuerpo de tubulina se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El reactivo Lipofectamine 3000, el reactivo Lipofectamine Plus (L3000015) y un anticuerpo AREG (PA5-109404) se adquirieron de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, EE. UU.). El TGF-β humano recombinante (100-21) y AREG humano recombinante (100-55B) se obtuvieron de PeproTech (Cranbury, NJ, EE. UU.). Se adquirieron un anticuerpo FN (ab2413) y un medio de montaje con DAPI (ab104139) de Abcam (Cambridge, Reino Unido), mientras que c-Jun se fosforiló (fosfo) en Ser63 (n.º 9261), JNK (n.º 9252), fosfo-JNK (Thr183 /Tyr185) (n.º 9251) y CCN2 (n.º 86641) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.). Se adquirió un anticuerpo fosfo-EGFR (Tyr1086) (36-9700) de ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). EGFR (sc-373746) y c-Jun (sc-74543) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EE. UU.). La inmunoglobulina G (IgG) (H + L) anti-conejo de cabra-peroxidasa de rábano picante (HRP) (C04003) y la IgG (H + L)-HRP (C04001) anti-ratón de cabra se adquirieron de Croyez Bioscience (Taipei, Taiwán) .
Cultivo de células
Las células epiteliales de pulmón humano (A549) se adquirieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.). Las células se cultivaron en una mezcla de nutrientes DMEM/F-12, que contenía 10 % de FBS, 100 U/ml de penicilina G y 100 μg/ml de estreptomicina, en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 y 95% N2 a 37 °C. Después de que las células A549 alcanzaran una confluencia del 80 %, las células se sembraron en placas de 6 cm para la inmunotransferencia.
Asma inducida por OVA en ratones
A los ratones hembra C57B/6 de 6 a 8 semanas de edad se les inyectaron por vía intraperitoneal 200 μl de 50 μg de OVA combinados con 4 mg de hidróxido de aluminio en solución salina tamponada con fosfato (PBS) los días 0, 7 y 14. Después de la sensibilización con OVA, los ratones se expusieron a aerosol de OVA (5 % en PBS) o aerosol de PBS durante 30 min, 2 días/semana durante 9 semanas.
transfección de ARNsi
Las células se transfectaron durante 24 h con ARNip de control, ARNip de AREG, ADAM17 o ARNip de EGFR (50 nM) usando lipofectamina® Reactivo 3000 con medio Opti. Las células se trataron con TGF-β o AREG (10 ng/ml) en los intervalos de tiempo indicados después de 24 h de transfección de siRNA. Los resultados se analizaron mediante transferencia Western.
ensayo de chip
Las células A549 se expusieron a AREG (10 ng/ml) durante 30 min y se fijaron con formaldehído durante 10 min. Se detectó la unión de AP-1 a la región promotora de CCN2…
