Resumen
Antecedentes
La inmunoterapia con péptidos (PIT) ofrece un tratamiento seguro y efectivo con efectos secundarios mínimos. Este estudio tiene como objetivo identificar epítopos de células B de un nuevo alérgeno de Blomia tropicalis (B. tropicalis), específicamente la proteína del dominio de unión a quitina tipo 2 (CHTBD2), y evalúa los efectos terapéuticos del tratamiento con péptidos en un modelo murino.
Métodos
Usando Alphafold2, se construyó la estructura 3D de ChtBD2. Las herramientas computacionales tradicionales y basadas en IA predijeron los epítopos predominantes de células B. Doce péptidos sintetizados se evaluaron por alergenicidad e inmunogenicidad. Se desarrolló y analizó un modelo murino de inflamación alérgica de las vías respiratorias alérgicas inducida por B. tropicalis imitando el asma atópica humana.
Resultados
Los epítopos predominantes de células B de ChTBD2 se identificaron como dominios prometedores de unión a IgE. El péptido 1 (PT1: 1-15) mostró una actividad significativa de unión a IgE y la tasa de inhibición más alta en los ensayos competitivos de unión a IgE. PT1 Reguló al alza IL-4, IL-13 y CD63 en PBMC y basófilos de pacientes sensibilizados con B. tropicalis, respectivamente. En particular, los grupos de TI mostraron una infiltración celular pulmonar reducida y la expresión de citocinas tipo 2 en BALF. Los niveles específicos de IgE se redujeron, con una disminución en la relación IgG1/IgG2A.
Conclusiones
Este estudio representa el primer desarrollo facilitado por AI de un PIT CHTBD2 basado en epítopos de células B, que muestra prometedor como inmunoterapia para pacientes con B. tropicalis alérgicos con alergenicidad reducida y alta inmunogenicidad en la inducción de anticuerpos bloqueantes de IgG.
Ensayo clínico
No aplicable.
Introducción
El asma alérgica es una de las enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias crónicas más comunes que afectan tanto a los adultos como a los niños a nivel mundial. En China, la prevalencia del asma entre las personas mayores de 20 años es de 4.26%, por un total de 45.7 millones de personas (1). En pacientes con asma alérgico, la IGE específica de alérgeno presente en el suero puede inducir respuestas inflamatorias tipo 2 locales y sistémicas. Aunque la farmacoterapia convencional se considera el tratamiento primario, carece de eficacia a largo plazo, y el uso frecuente puede conducir a resistencia a los medicamentos y posibles efectos secundarios. La inmunoterapia específica de alérgenos (AIT) es actualmente el único tratamiento que puede alterar el curso natural de las enfermedades alérgicas, ofreciendo eficacia a largo plazo y prevenir la progresión de la enfermedad (2). A pesar del reconocimiento de la eficacia de AIT por parte de la OMS, la capacidad de las moléculas IgE específicas de alérgenos para reticular células y/o basófilos presenta desafíos significativos, ya que aproximadamente el 5-35% de los pacientes sometidos a AIT pueden experimentar reacciones sistémicas adversas (3). Este problema surge principalmente porque las vacunas de alérgenos utilizadas en AIT a menudo son extractos crudos de alérgenos naturales, que exhiben una variabilidad significativa en la calidad (4‘6), carecen de alérgenos críticos y muestran diferencias sustanciales en la reactividad de IgE (7). Las variaciones en la calidad y la potencia de los extractos de alérgenos plantean preocupaciones significativas desde la perspectiva de la seguridad y el cumplimiento de los largos y engorrosos regímenes de AIT (8).
La predicción del epítopo es una rama crucial de la inmunoinformática con implicaciones significativas para el desarrollo de vacunas basadas en epítopos (9). Mediante el uso de alérgenos recombinantes purificados en diagnósticos, se pueden identificar alérgenos específicos, mientras que los algoritmos de inteligencia artificial pueden predecir estructuras de proteínas, epítopos de células B (10, 11), y epítopos MHC-II (12, 13), habilitando la inmunoterapia con precisión (13). En los últimos años, el uso de péptidos derivados de epítopos de proteínas de alérgenos para la desensibilización se ha considerado un enfoque prometedor para mejorar la seguridad de AIT. Los péptidos comunes de células T y epítopo de células B, que generalmente comprenden varias o docenas de residuos de aminoácidos, reducen los efectos secundarios aparentes de la inmunoterapia debido a su falta de tamaño y una estructura tridimensional necesaria para reticular IgE en las células efectoras. Sin embargo, los alérgenos recombinantes naturales aún retienen la reactividad de IgE y los epítopos de células T, lo que puede causar reacciones adversas inmediatas y retrasadas (14). En comparación con los péptidos epítopos de células T, los péptidos de epítopos de células B, que se seleccionan en base a sitios de unión de IgE y generalmente consisten en péptidos cortos que contienen un solo epítopo de células B, no reticulan IGE para provocar reacciones alérgicas y, por lo tanto, exhiben una alergenicidad más baja. Actualmente, la aplicación de epítopos de células B en AIT se centra principalmente en la inmunoterapia de polen. Por ejemplo, las vacunas de células B sintetizadas a partir de alérgenos de polen principales como Phl P 1 del polen de hierba de timoteo, Bet V 1 del polen de abedul y la hemocianina de la lápiz del ojo de la leña (KLH) (15, 16). Estos péptidos epítopos de células B pueden aumentar significativamente los anticuerpos IgG específicos de alérgenos, inhibiendo así la reactividad específica de IgE y la activación de basófilos por alérgenos naturales, protegiendo contra la inflamación alérgica ((17). Además, la falta de epítopos de células T específicas de alérgenos, estos péptidos no activan las respuestas de células T específicas de alérgenos, reduciendo la producción de citocinas inflamatorias relacionadas y aliviando los síntomas de alergia.
En la última década, la prevalencia de enfermedades alérgicas causadas por Blomia tropicalis ha estado en aumento, alterando e influyendo en la reactividad global de IgE a los ácaros ((18‘20). B. tropicalis es ampliamente reconocida como una fuente importante de alérgenos aéreos interiores, que exhibe heterogeneidad en sus componentes alergénicos, con una relevancia clínica variable. La alta prevalencia de la sensibilización de B. tropicalis requiere el desarrollo de tratamientos efectivos con una eficacia significativa.
En este estudio, aplicamos estrategias de inteligencia artificial para identificar epítopos de células B del alergeno principal potencial recientemente descubierto con un dominio de unión a quitina tipo 2 (CHTBD2) que se encuentra en B. tropicalis. Caracterizamos la alergenicidad y la inmunogenicidad de estos péptidos de epítopos de células B utilizando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo de inhibición ELISA competitivo, prueba de activación de basófilos y análisis de expresión de citocina en células mononucleares periféricas (PBMC). Además, establecimos modelos murinos sensibilizados por B. tropicalis de asma alérgica tipo 2 para evaluar la eficacia inmunoterapéutica de los péptidos de epítopos de células B predichos. Proponemos que el diseño impulsado por la IA de péptidos de epítopo de células B representa una estrategia prometedora y un candidato a la vacuna para la inmunoterapia de pacientes con B. tropicalis alérgicos (Fig. 1).
Resumen gráfico. En este estudio, tanto el CHTBD2 recombinante como su péptido derivado de células B (PT1) mostraron una eficacia similar en la reducción de la inflamación mediante la regulación negativa de las citocinas tipo 2, así como la infiltración celular y la producción de moco en los pulmones del modelo murino de blomia tropicalis inducida por la vía aérea alérgica imitando a la Atópica humana ascópica.
Métodos
Construcción y evaluación de calidad de la estructura terciaria CHTBD2
Para desarrollar vacunas peptídicas, utilizamos la secuencia de aminoácidos de la proteína del dominio de unión a quitina tipo 2 (CHTBD2), identificada recientemente de Blomia tropicalis (GenBank ID: KAJ6215440.1). Esta secuencia se envió a Alphafold2 para crear un modelo tridimensional (3D) (21). Evaluamos la calidad del modelo utilizando el servidor Saves V6.0 (https://saves.mbi.ucla.edu/), incluyendo herramientas como Procheck (22) y errat (23). Luego se visualizó la estructura utilizando el software Pymol (https://pymol.org/2/).
Predicción de epítopos de células T
Utilizamos Tepitool para identificar regiones en la proteína que podrían desencadenar una respuesta de células T (http://tools.iedb.org/tepitool/) (24). El análisis incluyó los 26 alelos humanos de clase II más comunes de HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP, centrándose en secuencias con un rango de 10 o menos. Los epítopos de células T fueron elegidos de regiones que aparecieron en dos o más de estos alelos.
Predicción de epítopos de células B y alergenicidad de epítopos sintetizados de células B
Predecimos epítopos lineales de células B utilizando métodos basados en IA y tradicionales. La estructura 3D de Chtbd2 se analizó con el servidor Elipro (http://tools.iedb.org/ellipro/) (25) para encontrar epítopos de células B, utilizando un umbral de puntaje de> 0.5. Se hicieron predicciones adicionales con Bepipred 2.0 (http://tools.iedb.org/bcell/) (26) y Graphbepi (http://bio-web1.nscc-gz.cn/app/graphbepi), con un umbral de 0.5 en Bepipred 2.0. Los epítopos finales de células B se seleccionaron de las regiones identificadas por al menos dos métodos.
También predijimos epítopos conformacionales de células B, que son importantes para la alergenicidad en los alérgenos inhalantes, utilizando la SEMA AI (http://sema.airi.net) (27, 28) Método con un umbral de 0.6. Todos los resultados se combinaron, y los péptidos de epítopos de células B seleccionados fueron sintetizados por Taopu-Biotech Company (Nanjing, China).
Síntesis de péptidos
Los péptidos se sintetizaron a través de la síntesis de péptidos de fase sólida basada en FMOC (SPP) en la resina MBHA de amida de la pista (0,5 mmol/g). La hinchazón de resina (DMF, 30 min) fue seguida por la desprotección iterativa de FMOC (20% de piperidina/DMF), acoplamiento de aminoácidos (HBTU/Hobt/Diea, 4 equives, 1 h) y lavados DMF. Las secuencias desafiantes utilizaron asistencia de microondas (50 ° C, 20 min) o agentes anti-agregación. Los péptidos se escinden con TFA/H2O/TIS/EDT (95: 2.5: 1.25: 1.25, 2 h), precipitados en éter frío y liofilizado. La purificación por RP-HPLC (C18, gradiente de TFA/ACN al 0.1%) produjo> 95% de péptidos puros (HPLC, MALDI-TOF). Los péptidos se almacenaron a – 80 ° C.
Colección de temas y sueros
Este protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del primer hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Guangzhou (GYFYY-2017-18). Reclutamos 107 pacientes sensibilizados a Blomia tropicalis de la clínica de alergias, confirmado por niveles de SIGE por encima de 0.35 ku/L utilizando el sistema inmunocap. Entre ellos, 74 eran mujeres y 33 eran hombres, con una edad media de 18 años (que oscilaba entre 3 y 51 años) y un nivel promedio de SIGE de 7.12 ku/L. También reclutamos a diez participantes no alérgicos como controles, como se describió anteriormente (29). El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes o sus guardianes. Se proporcionan más detalles en un archivo adicional S1.
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