Resumen
Fondo
La lesión pulmonar inducida por radiación (RILI) es la complicación más común y grave de la radioterapia de tórax. Sin embargo, los agentes radioprotectores informados generalmente conducen a la resistencia a la radiación en las células tumorales. La clave para resolver este problema es distinguir entre la respuesta de las células tumorales y las células epiteliales pulmonares normales al daño por radiación.
Métodos
Se usó RNA-Seq para reconocer el objetivo potencial de aliviar la progresión de RILI, así como para inhibir el crecimiento tumoral. La activación del inflamasoma NLRP3 en las células epiteliales de pulmón se examinó mediante qRT-PCR, transferencia Western, inmunofluorescencia y ELISA. Se construyó un modelo in vivo de RILI y un modelo de cultivo acondicionado in vitro para evaluar el efecto de NLRP3/interleucina-1β en la activación de fibroblastos. ROS, ATP y (NADP)+Se detectó el nivel de /NADP(H) en las células epiteliales del pulmón para explorar el mecanismo de activación del inflamasoma NLRP3. Se eliminaron los macrófagos pulmonares de los ratones para evaluar el papel de las células epiteliales pulmonares en RILI. Además, se extrajeron células primarias para validar los resultados obtenidos a partir de líneas celulares.
Resultados
La activación de NLRP3 en las células epiteliales después de la radiación depende de la acumulación de especies reactivas de oxígeno relacionadas con la glucólisis. DPYSL4 se activa y actúa como regulador negativo de este proceso. El inflamasoma NLRP3 desencadena la secreción de interleucina-1β, que afecta directamente la activación, proliferación y migración de los fibroblastos, lo que eventualmente conduce a la fibrosis pulmonar.
Conclusiones
Nuestro estudio sugiere que la activación del inflamasoma NLRP3 en las células epiteliales del pulmón es esencial para la lesión pulmonar inducida por la radiación. Estos datos indican claramente que centrarse en NLRP3 puede ser eficaz para reducir las lesiones pulmonares inducidas por la radiación en entornos clínicos.
Introducción
La radioterapia torácica es fundamental en pacientes con neoplasias malignas torácicas y mamarias. Sin embargo, el daño a los pulmones inducido por la radiación sigue siendo una barrera importante para una mejor implementación de la radioterapia. La lesión pulmonar inducida por radiación (RILI) se puede dividir en neumonitis por radiación temprana (RP) y fibrosis pulmonar inducida por radiación tardía (RPF) [1]. RILI está asociado con un mayor riesgo de muerte, discapacidad y una disminución en la calidad de vida [2]. La FPR se caracteriza por la proliferación de fibroblastos, el depósito de colágeno y la destrucción de la arquitectura pulmonar normal, lo que provoca disnea e insuficiencia respiratoria. [3]. Dado el creciente número de sobrevivientes de cáncer a largo plazo, es de vital importancia mitigar o prevenir los efectos tardíos de la radioterapia. Sin embargo, la biología y los mecanismos moleculares del RPF no se han dilucidado por completo.
La inflamación es un elemento clave de RILI. Los inflamasomas son esenciales para la inmunidad innata y las respuestas al daño celular. La activación de los inflamasomas conduce a una muerte inflamatoria llamada piroptosis. [4]. El inflamasoma3 que contiene el dominio de pirina de la familia de receptores de oligomerización de unión a nucleótidos (NLRP) es el inflamasoma más estudiado y puede ser activado por una serie de estímulos, y se ha relacionado con la patogénesis de varios trastornos inflamatorios, incluida la criopirina. síndromes periódicos asociados, enfermedad de Alzheimer, gota, enfermedades autoinflamatorias y aterosclerosis [5]. Estudios previos también han demostrado que el inflamasoma NLRP3 está involucrado en enfermedades fibróticas, incluida la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) [6]. NLRP3 interactúa con una proteína adaptadora bipartita, conocida como proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasa (ASC), y promueve el reclutamiento de pro-caspasa-1 (CASP1) en el complejo del inflamasoma. CASP1 activo luego escinde las citocinas pro-interleucina (pro-IL)-1β y pro-IL-18 en formas maduras y biológicamente activas [7]. La citocina interleucina (IL)-1β es una potente citocina proinflamatoria que se ha demostrado que promueve la síntesis de colágeno [8]. Se ha demostrado que la IL-1β desempeña un papel en la aparición, invasión y metástasis de múltiples tipos de tumores [9]. Queda por explorar si la inhibición del inflamasoma NLRP3 tiene el potencial de mitigar el daño por radiación al tejido pulmonar normal e inhibir una mayor progresión de los tumores.
Algunos estudios han sugerido la participación de los inflamasomas en RILI, pero se han centrado principalmente en los macrófagos. [10,11,12]. El papel de las células epiteliales de pulmón en RILI queda por dilucidar. Las células epiteliales de las vías respiratorias se consideran la primera línea de defensa del huésped contra la invasión dañina y participan en el inicio y la progresión de la inflamación. Las células epiteliales de las vías respiratorias expresan una gran cantidad de receptores de reconocimiento de patrones, que pueden percibir rápidamente los patrones moleculares asociados con los patógenos, así como los patrones moleculares asociados con el daño liberados por el tejido dañado, y luego generar una serie de respuestas, como la liberación de citocinas y quimiocinas. [13]. En el asma, las células epiteliales de las vías respiratorias detectan los alérgenos y reclutan células inmunitarias. Las células inmunitarias reclutadas secretan una gran cantidad de quimiocinas y citocinas que causan más daño a las células epiteliales, lo que resulta en la mejora y persistencia de la respuesta inflamatoria. [14]. Por lo tanto, estudiar el papel de los inflamasomas en el epitelio de las vías respiratorias en RILI puede proporcionar nuevos conocimientos para la prevención de la disfunción epitelial.
Las alteraciones metabólicas se reconocen cada vez más como procesos patogénicos importantes que subyacen a las enfermedades fibróticas [15]. El metabolismo de la glucosa comienza con su conversión en piruvato y termina con la producción de ácido láctico en el citoplasma, lo que se denomina glucólisis. [16]. El cambio metabólico que experimentan las células cancerosas hacia la glucólisis aeróbica, en lugar de metabolizarse por completo a dióxido de carbono a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS), se identificó como el efecto Warburg [17]. El efecto Warburg da como resultado una producción más rápida de intermediarios biosintéticos, así como de adenosina 5′-trifosfato (ATP), que luego se puede usar para la síntesis de proteínas y la proliferación celular. Del mismo modo, la síntesis de proteínas mejorada y la producción de los mismos intermediarios biosintéticos son el sello distintivo de la fibrosis. [18]. Además, el efecto Warburg conduce a la FPI al mejorar la activación de los miofibroblastos. [19]. Por lo tanto, apuntar al efecto Warburg puede ser una posible estrategia terapéutica para la fibrosis. Sin embargo, su papel en el RPF sigue sin estar claro.
Aquí, nuestro objetivo fue diferenciar la respuesta a la radiación entre las células tumorales de pulmón y las células epiteliales de pulmón normales, e investigamos la función de los inflamasomas NLRP3 en las células epiteliales de pulmón en RILI. En particular, revelamos preliminarmente la relación entre el metabolismo de la glucosa y la activación del inflamasoma en RILI. Estos datos proporcionan evidencia de que NLRP3 puede servir como un objetivo terapéutico prometedor en RILI.
Métodos y materiales
Aislamiento celular y cultivo.
La línea de células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B y HBE, la línea de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas A549 y la línea de células de cáncer de pulmón de células pequeñas H446 se compraron del Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences (Beijing, China) y se cultivado en RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % a 37 °C en dióxido de carbono al 5 %.. Las células epiteliales bronquiales humanas primarias (PHBE) y los fibroblastos pulmonares primarios (HLF) se aislaron y cultivaron a partir de tejido pulmonar humano recién extirpado quirúrgicamente como se describió anteriormente. [20]. Se aislaron fibroblastos de embrión de ratón primario (MEF) de embriones de ratón C57/BL6 preñado. Se extrajo el útero y se colocó en una solución balanceada de fosfato. Después de quitar la cabeza y otros órganos internos, los embriones se cortaron en pequeños pedazos. El tejido se centrifugó a 1000 rpm/5 min y se resuspendió en tripsina y luego se digirió en una incubadora a 37 °C durante aproximadamente 30 min. Las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min y se cultivaron en RPMI-DMEM que contenía FBS al 10 %.
Muestras de pulmón humano
Se obtuvieron muestras de pulmón fibrótico de 8 pacientes con neumonía organizada que se sometieron a una resección pulmonar parcial. Controla el tejido pulmonar…
