Resumen
La fibrosis pulmonar (FP) es una enfermedad pulmonar crónica y progresiva caracterizada por proliferación de fibroblastos, matriz extracelular extensa y depósito de colágeno, acompañada de daño inflamatorio que, en última instancia, conduce a la muerte por insuficiencia respiratoria. De hecho, se reconoce que el estrés del retículo endoplásmico (RE) en el tejido fibrótico pulmonar es un factor importante que exacerba el desarrollo de la PF. Las evidencias emergentes indicaron una posible asociación entre el estrés del RE inducido por el lactato y la apoptosis celular en la PF. Sin embargo, los mecanismos de este proceso necesitan mayor aclaración. En este artículo, el modelo de fibrosis pulmonar fue inducido por bleomicina (BLM) por vía intratraqueal en ratones. En el modelo celular, las células epiteliales tipo II fueron tratadas con lactato y TGF-β para detectar marcadores de apoptosis y estrés del RE. El lactato podría promover la respuesta al estrés del RE y la apoptosis. Mecánicamente, el lactato activó la caspasa-12 a través del eje ATF4-Chop para inducir la apoptosis celular y promover la fibrosis. El inhibidor del estrés del RE podría suprimir eficazmente la apoptosis de las células epiteliales alveolares y la fibrosis pulmonar. Concluimos que las propiedades profibróticas del lactato están asociadas con la apoptosis de las células epiteliales alveolares al causar estrés en el RE y, por lo tanto, proporcionan nuevos objetivos terapéuticos potenciales para la fibrosis pulmonar.
Introducción
La fibrosis pulmonar (FP) es una enfermedad pulmonar intersticial crónica e irreversible, cuya etiología no ha sido completamente dilucidada. Su característica es el depósito anormal de tejido fibroso en el parénquima pulmonar, acompañado de morbilidad significativa y mal pronóstico.1). Además, la PF se acompaña de la generación de un número significativo de células epiteliales alveolares frágiles de tipo II. Estas células demostraron características de proliferación y diferenciación en células AT1, acompañadas de activación de miofibroblastos y depósito de matriz. La aparición repetida de reacciones de reparación conduce a la formación de cicatrices y pérdida de la estabilidad estructural pulmonar, lo que finalmente resulta en PF.2, 3).
El lactato, como principal producto de la glucólisis y una importante molécula de señalización, jugó un papel clave en la progresión tumoral y la determinación del destino celular.4, 5). El lactato, como producto metabólico, su acumulación en el tejido pulmonar puede afectar la supervivencia y función celular. La acumulación de lactato puede afectar el microambiente del tejido pulmonar, promoviendo así el proceso de fibrosis (6, 7). El alto estado oxidativo de AECII se manifestó en una preferencia por el lactato como sustrato metabólico para la producción de ATP mitocondrial. Estudios anteriores han demostrado que el contenido de lactato en los pulmones estaba elevado en PF (8). La desregulación metabólica de las células AEC2 fue uno de los principales factores impulsores de la progresión de la PF. Las enzimas glicolíticas, especialmente la lactato deshidrogenasa (LDH), podrían servir como dianas terapéuticas para ayudar a combatir el ambiente profibrótico, inhibiendo así la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos.9).
La apoptosis juega un papel importante en muchos procesos fisiológicos (10, 11). La apoptosis de las células epiteliales es un proceso clave en diversas enfermedades fibróticas de órganos, incluidos los pulmones.12, 13). Durante el proceso de fibrosis, la apoptosis de las células epiteliales puede causar daño a la capa epitelial y un desequilibrio en los mecanismos de reparación, promoviendo así el FP. Estudios posteriores han demostrado que limitar la pérdida de la función de las células AT2 mediante la inhibición de fármacos o genes de la vía de la apoptosis también alivió la fibrosis en ratones.14). Estas observaciones fortalecieron la teoría de que la alteración de la homeostasis epitelial alveolar promueve el desarrollo de fibrosis pulmonar.15, 16). Sin embargo, estos estudios no explicaron cómo las células AT2 disfuncionales, además de la apoptosis, contribuyen al desarrollo de la FPI.17, 18).
El RE es el orgánulo celular responsable de sintetizar, plegar y modificar proteínas secretoras y proteínas transmembrana. Cualquier estimulación puede alterar su capacidad de plegamiento de proteínas, lo que lleva a estrés en el RE, como hipoxia, lactato, acumulación de especies reactivas de oxígeno y alteración de la homeostasis de los iones de calcio.19,20,21). El ATF4 (factor activador de transcripción 4) está regulado por diversos estímulos y estrés, incluido el estrés del RE, el estrés oxidativo y la limitación de nutrientes en las células. Una vez que la célula está bajo estrés, puede regular la transcripción de múltiples genes para hacer frente a los desafíos. CHOP, también conocida como C/EBP (proteína de unión a potenciador de CCAAT): proteína homóloga. Es un objetivo clave para activar la vía ATF4 (22). La caspasa-12 es una de las proteínas de la membrana externa del RE, que no se puede activar en la vía y el receptor de la membrana. Es una vía apoptótica específica para el estrés del RE y es la molécula de ejecución final que media la apoptosis celular inducida por el estrés del RE (23). La caspasa-12 media la apoptosis celular mediante la activación de caspasa-9 y caspasa-3, y puede promover la apoptosis relacionada con ERS. La investigación ha encontrado una asociación entre CHOP y caspasa-12, donde la sobreexpresión de CHOP promueve la reacción en cascada de las caspasas, liberando caspasa-12 y, en última instancia, conduce a la apoptosis en las células. El estrés del RE puede promover la PF a través de múltiples tipos de células pulmonares, incluidas las células epiteliales alveolares, los fibroblastos y los macrófagos.13).
En este estudio, tratamos células A549 con lactato y detectamos la expresión de marcadores de estrés del RE y proteínas apoptóticas para explorar la relación entre el lactato, el estrés del RE y la apoptosis. Los datos revelaron que la apoptosis inducida por lactato estaba mediada por el estrés del RE. El estrés del RE indujo la activación del eje ATF4-Chop, que fue responsable de activar la Caspasa-12 y mejorar la expresión de Bax, mientras regulaba negativamente Bcl-2. Además, el inhibidor del estrés del RE (4-PBA) podría aliviar la apoptosis de las células epiteliales alveolares y suprimir la PF. Aquí, aclaramos la apoptosis de las células epiteliales alveolares inducida por lactato para promover la PF a través del eje ATF4-Chop-Caspasa12 al causar estrés en el RE. Estos datos pueden proporcionarnos nuevos conocimientos sobre el desarrollo de la PF y posibles objetivos para el tratamiento de la PF.
Materiales y métodos
Reactivos y anticuerpos.
El lactato se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.), El anticuerpo contra Caspasa-12 (n.º 35965) se adquirió de Cell Signaling Technology (Boston, MO, EE. UU.). El anticuerpo contra CHOP (#66741-1-Ig), Bax (#50599-2-Ig), Bcl-2 (#68103-1-Ig) y ATF4 (#60035-1-Ig) se adquirió de Proteintech (Wuhan, Porcelana). El anticuerpo contra PERK (#AF5304), Phospho-PERK (Thr982) (#DF7576), IRE1 (#DF7709), Phospho-IRE1 (Ser724) (#AF7150) y β-Actina (#AF7018) se adquirió de Affinity (Changzhou, Porcelana).
cultivo celular
La línea celular A549 de células epiteliales de pulmón y células epiteliales alveolares de ratón MLE se obtuvieron del Centro de Colección de Cultivos Tipo del Instituto de Ciencias de la Vida de Shanghai, Academia de Ciencias de China. Las células se cultivaron en un medio completo que consistía en medio basal DMEM/F12, solución de penicilina-estreptomicina al 1% (penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml) y FBS (suero bovino fetal) al 10%. Las celdas se mantuvieron en condiciones controladas con una temperatura de 37 ℃, 95 % de aire y 5 % de CO2. Al alcanzar ~ 70% de densidad celular, se utilizaron para experimentos posteriores y se sembraron en varios tipos de placas celulares. Estas células se utilizaron 10 ng/ml de TGF-β de Shanghai Novo Protein para establecer un modelo de fibrosis in vitro y se trataron previamente con fármacos que incluían lactato 10 mM, 4-PBA 500 nM y cinconina 50 µM adquiridos de Medchem Expression en Nueva York. Jersey, Estados Unidos.
Ratones
Todos los experimentos con animales en este manuscrito fueron aprobados por el Comité Académico de Biología de la Universidad Normal de Henan. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 como modelo experimental. Todos los animales de experimentación se alojaron en laboratorios de animales de nivel SPF y se manejaron de acuerdo con protocolos internacionales para el uso y protección de animales. Durante los experimentos, los ratones se dividieron aleatoriamente en diferentes grupos experimentales y se alojaron en las mismas condiciones ambientales. Los ratones tuvieron libre acceso a comida y agua, con una temperatura ambiental mantenida entre 22 °C y 24 °C, una humedad relativa del 40-60% y un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. A lo largo del experimento, se siguió estrictamente los estándares éticos para la experimentación con animales con el fin de minimizar el dolor y el sufrimiento de los animales.
Análisis cuantitativo por RT-PCR.
El ARN total se extrajo de tejidos y células utilizando el reactivo Trizol. Posteriormente, se transcribió de forma inversa 1 μg de ARN utilizando la transcriptasa inversa HiScript II (Vazyme, Nanjing, China). El ADN complementario resultante se utilizó para la amplificación por PCR en tiempo real en un sistema de PCR rápido en tiempo real utilizando Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (Yeasen Biotechnology, Shanghai, China). Los cebadores oligonucleotídicos utilizados para la amplificación de qPCR se enumeran en la Tabla 1. Los niveles de expresión relativos de los genes diana se determinaron utilizando el método 2-ΔΔCt. Todos los experimentos se realizaron con tres repeticiones.
Tabla 1 Secuencias de cebadoresmesa de tamaño completomancha occidental
Las proteínas se extrajeron de tejidos y células utilizando tampón RIPA y sus concentraciones se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific). Los lisados de proteínas se separaron en geles de poliacrilamida-SDS al 10-15%, con una carga de 20-50 μg cada vez. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), seguido de bloqueo con leche desnatada en polvo a temperatura ambiente durante 1 h para evitar la unión no específica. Posteriormente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios específicos como se describió anteriormente en función del tamaño de la banda objetivo. Se utilizó β-actina como control interno. Al día siguiente, las bandas se lavaron tres veces con tampón TBST y luego se trataron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP a temperatura ambiente durante 2 h. Después de tres lavados adicionales con tampón TBST, se detectó inmunorreactividad utilizando el sistema mejorado de Thermo Scientific…
