Abstracto
Fondo
El mioinositol (o inositol) y sus derivados no solo funcionan como metabolitos importantes para múltiples procesos celulares, sino que también actúan como cofactores y segundos mensajeros en las vías de señalización. Aunque la suplementación con inositol se ha estudiado ampliamente en varios ensayos clínicos, se sabe poco sobre su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática (FPI). Estudios recientes han demostrado que los fibroblastos pulmonares IPF muestran dependencia de la arginina debido a la pérdida de argininosuccinato sintasa 1 (ASS1). Sin embargo, los mecanismos metabólicos que subyacen a la deficiencia de ASS1 y su consecuencia funcional en los procesos fibrogénicos aún no se han dilucidado.
Métodos
Los metabolitos extraídos de fibroblastos pulmonares primarios con diferentes estados de ASS1 se sometieron a análisis metabolómicos no dirigidos. Se evaluó una asociación de la deficiencia de ASS1 con inositol y su señalización en fibroblastos pulmonares mediante ensayos de biología molecular. El potencial terapéutico de la suplementación con inositol en fenotipos de fibroblastos y fibrosis pulmonar se evaluó en estudios basados en células y en un modelo animal con bleomicina, respectivamente.
Resultados
Nuestros estudios de metabolómica mostraron que los fibroblastos pulmonares deficientes en ASS1 derivados de pacientes con FPI habían alterado significativamente el metabolismo del fosfato de inositol. Observamos que la disminución de la abundancia de inositol-4-monofosfato y el aumento de la abundancia de inositol se asociaron con la expresión de ASS1 en fibroblastos. Además, la eliminación genética de la expresión de ASS1 en fibroblastos pulmonares normales primarios condujo a la activación de los signalosomas mediados por inositol, incluida la señalización de EGFR y PKC. El tratamiento con inositol redujo significativamente las vías de señalización mediadas por la deficiencia de ASS1 y redujo la invasividad celular en los fibroblastos pulmonares de FPI. En particular, la suplementación con inositol también mitigó las lesiones fibróticas inducidas por bleomicina y la deposición de colágeno en ratones.
Conclusión
Estos hallazgos, tomados en conjunto, demuestran una nueva función del inositol en el fibrometabolismo y la fibrosis pulmonar. Nuestro estudio proporciona nueva evidencia de la actividad antifibrótica de este metabolito y sugiere que la suplementación con inositol puede ser una estrategia terapéutica prometedora para la FPI.
Fondo
La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es la enfermedad pulmonar intersticial más frecuente con características crónicas y progresivas que conducen a una disminución de la función pulmonar y, en última instancia, a insuficiencia pulmonar [1, 2]. Se cree que las lesiones fibróticas observadas en la FPI son impulsadas principalmente por fibroblastos, particularmente miofibroblastos, que son los principales tipos de células responsables de la progresión fibrótica. Este proceso está mediado por la formación de lesiones focales de fibroblastos activos, la producción exuberante y el depósito de matriz extracelular (MEC), que en última instancia conduce al engrosamiento del intersticio y la distorsión de la arquitectura pulmonar. [3,4,5]. La enfermedad exhibe una mediana de supervivencia de menos de 5 años desde el momento del diagnóstico debido a la falta de terapias efectivas. [6, 7]. Si bien dos opciones de tratamiento actualmente disponibles, nintedanib y pirfenidona, pueden mejorar la función pulmonar en los pacientes, ambos medicamentos no logran detener de manera efectiva la fibrosis pulmonar, con poco o ningún efecto sobre la mortalidad general [7, 8]. Por estas razones, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas y mejores opciones terapéuticas para las personas diagnosticadas con FPI.
Estudios recientes demuestran que la expresión desregulada de enzimas metabólicas y los niveles alterados de metabolitos están involucrados en la patogénesis de la FPI [9,10,11] donde la reprogramación metabólica modula las actividades fibróticas de los fibroblastos pulmonares [12]. Se ha demostrado que la inhibición de la glucólisis, glutaminólisis o biosíntesis de arginina reduce la fibrosis pulmonar en modelos animales, lo que sugiere apuntar a la reprogramación metabólica de los fibroblastos pulmonares fibróticos como una vía terapéutica viable para la FPI [13,14,15,16]. Hemos identificado previamente la regulación a la baja de la argininosuccinato sintasa 1 (ASS1), una enzima limitante de la velocidad en de novo biosíntesis de arginina, en tejidos fibróticos de pulmón IPF y fibroblastos. Dado que los fibroblastos pulmonares de FPI con deficiencia de ASS1 requieren la absorción de arginina extracelular para sobrevivir debido a la incapacidad de sintetizar arginina endógenamente, las estrategias de privación de arginina, incluida la dieta libre de arginina y la arginina deiminasa (ADI) que degrada la arginina extracelular, demuestran efectos antifibróticos en la reducción del colágeno. contenido y lesiones fibróticas en el pulmón de ratones expuestos a bleomicina [16]. Aunque la terapia con ADI exhibió resultados prometedores, varios estudios sobre el cáncer informaron que esta terapia desencadena inevitablemente la resistencia a la ADI a través de la inducción de la expresión de ASS1 y la activación de vías de señalización alternativas en células negativas para ASS1 [17, 18]. Dadas estas deficiencias, es muy necesario el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la fibrosis pulmonar dependiente de arginina.
El mioinositol (o inositol) es un compuesto natural proporcionado por la ingesta dietética y/o sintetizado endógenamente a través de la vía de la glucólisis. [19]. Como precursor de segundos mensajeros, el inositol regula una serie de vías de transducción de señales y circuitos metabólicos en las células. [20, 21]. Uno de los metabolitos derivados del inositol más comunes, el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2), se hidroliza en diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) para mediar Ca2+ señalización y activación de las isoformas de la proteína quinasa C convencional (cPKC) [21, 22]. Dado que el metabolismo del inositol desempeña un papel fundamental en diferentes aspectos de las condiciones fisiológicas, se ha considerado el inositol para tratar una amplia variedad de afecciones, desde el síndrome de dificultad respiratoria del recién nacido hasta el cáncer de pulmón. [23, 24]. A pesar de estos hallazgos, nuestra comprensión de la función del inositol en otras enfermedades pulmonares como la fibrosis pulmonar sigue siendo incompleta. En este estudio, no solo caracterizamos los perfiles metabolómicos de los fibroblastos pulmonares fibróticos derivados de pacientes con FPI, sino que también identificamos vías metabólicas fibrógenas impulsadas por la deficiencia de ASS1. Además, determinamos el potencial terapéutico del inositol en la FPI mediante ensayos basados en células in vitro y un modelo animal in vivo de fibrosis pulmonar.
Materiales y métodos
reactivos y anticuerpos
Todos los reactivos y anticuerpos utilizados en este estudio se describen en Métodos complementarios en el suplemento en línea.
Cultivo celular y transfección.
Se obtuvieron células de fibroblastos primarios humanos a partir de tejidos de las vías respiratorias proporcionados por el Centro Médico UC Davis (Sacramento, CA) con el consentimiento como se describió anteriormente. [16]. El protocolo para la obtención y el uso de tejidos humanos fue revisado y aprobado periódicamente por la Junta de Revisión Institucional de UC Davis. Los procedimientos experimentales detallados para el establecimiento de cultivos celulares y transfecciones de ARNip se describen en Métodos complementarios en el suplemento en línea.
Análisis GC-TOF MS no dirigido
Las muestras de fibroblastos pulmonares congelados se enviaron al Centro de Metabolómica de la Costa Oeste en UC Davis, y las células se analizaron mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas de tiempo de vuelo (GC-TOFMS) como se describió anteriormente. [25]. El procedimiento experimental detallado para GC-TOF MS y el análisis de datos se describen en Métodos complementarios en el suplemento en línea.
Ensayos de mioinositol
El contenido de inositol en células de fibroblastos de pulmón se midió utilizando un kit de ensayo de mioinositol según el protocolo del fabricante (Abcam, Cambridge, MA). El procedimiento experimental detallado se describe en Métodos complementarios en el suplemento en línea.
Modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina
Ratones hembra C57BL/6J de 8 semanas de edad comprados en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.) se alojaron 4 ratones por jaula y se alimentaron con comida de laboratorio para roedores ad libitum. Se administró solución salina o bleomicina por vía intratraqueal a ratones C57BL/6J como se describió anteriormente [16, 26, 27]. Los procedimientos experimentales detallados se describen en Métodos complementarios en el suplemento en línea. Los procedimientos de todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC)…
