Resumen
Si bien se ha considerado que la inmunidad adaptativa TH2 orquesta la inflamación tipo 2 en el pulmón alérgico, el grupo 2 células linfoides innatas (ILC2), con la capacidad de producir un perfil similar de citocinas tipo 2, probablemente participe en la inflamación pulmonar en la asma alérgica. Los ILC2 también están implicados en las disparidades sexuales en el asma, respaldados por datos de modelos murinos que muestran que están inhibidos por las hormonas sexuales masculinas. Además, un mayor número de ILC2 están presentes en los pulmones de los ratones hembra y se correlacionan con una mayor inflamación de tipo 2. Los ILC2 de pulmón exhiben respuestas intrigantes en forma de memoria, aunque si estos difieren en hombres y mujeres no parece haber sido abordado. Hemos examinado la inflamación pulmonar tipo 2 en ratones BALB/C hembra masculinos y hembras adultos después de la entrega de IL-33 al pulmón. Mientras que el número de ILC2S se elevó por igual en machos y mujeres cuatro semanas después de la exposición a IL-33, los ILC2 de ratones hembra expresaron niveles más altos de ST2, la subunidad del receptor cognado de IL-33 y una mayor proporción de ILC2 de las hembras expresaron la IL IL. -25 receptor (IL-25R), que previamente se ha relacionado con respuestas de ILC2 similares a la memoria en ratones. Nuestros datos muestran que el subconjunto de ILC2s que expresan IL-25R, tras la activación, era más probable que produzca IL-5 e IL-13. Además, STAT6 fue absolutamente necesario para una capacidad de respuesta mejorada en este sistema modelo. En total, nuestros datos muestran que la inflamación mejorada de tipo 2 en las mujeres está vinculada a cambios duraderos en subconjuntos de ILC2 con la capacidad de responder de manera más robusta, de manera dependiente de STAT6, tras la activación secundaria por citocinas innatas derivadas epiteliales.
Introducción
El asma es una condición crónica caracterizada por la inflamación de las vías respiratorias, la hiperreactividad bronquial, la hiperplasia de las células caliciformes e hipertrofia del músculo liso (1). Los datos abundantes respaldan un papel para la inflamación tipo 2 en el asma alérgica: el fenotipo más común del asma. La inflamación alérgica de las vías respiratorias se asocia con aumentos en las células Helper CD4+ T tipo 2 (Th2), células B secretoras de IgE, eosinófilos, mastocitos y células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2). Las células Th2 e ILC2 producen citocinas tipo 2, incluidas IL-4, IL-5 e IL-13, que orquestan las respuestas inflamatorias en el pulmón, incluida la reclutamiento y activación de eosinófilos, hiperplasia de células caliciformes e hiperactividad de las vías aéreas (AHR).
En los modelos murinos de la enfermedad alérgica de las vías respiratorias, los ILC2 contribuyen significativamente a la población general de células que producen IL-5 e IL-13 (2,3,4). Los ILC2 de pulmón se consideran objetivos importantes de las citocinas derivadas de células epiteliales, incluida la IL-25, la linfopoyetina del estroma tímico (TSLP) e IL-33, aunque una amplia variedad de mediadores modula la activación o inhibición de ILC2 (5). IL-33 generalmente se considera la más potente de las alarmas, aunque los ILC2 tienen la capacidad de responder a cada una de estas citocinas. IL-33 y TSLP promueven su expresión de manera recíproca (6); y la activación de ILC2 por TLSP se asocia con resistencia a los esteroides tanto en humanos como en ratones (7, 8).
Más hombres que mujeres son diagnosticados con asma antes de la pubertad, con un cambio en los adultos, donde la prevalencia es mayor en las mujeres que, además, a menudo experimentan formas más graves de la enfermedad (9, 10). Los datos abundantes de los estudios en humanos y los modelos murinos implican las hormonas sexuales en estas diferencias, con andrógenos inhibidos y estrógenos que promueven la enfermedad (11,12,13,14). Recientemente, la modulación de ILC2 por hormonas sexuales se ha definido en varios estudios. Los ratones hembras tienen un mayor número de ILC2, principalmente debido a la presencia de una población de ILC2 que no expresan el receptor G1 de celos asesinos como el receptor G1 (KLRG1) (13, 15). La asociación KLRG1 con E-cadherina, presente en las células epiteliales pulmonares, inhibe los ILC2 in vitro (16); Por lo tanto, se ha propuesto que KLRG1 – ILC2S pueden tener una mayor actividad. Mientras que los andrógenos regulan negativamente los ILC2 de pulmón (12,13,14) y los estrógenos son en gran medida sin efecto (11), la progesterona puede regular positivamente los ILC2 (17). Sin embargo, en los ratones, los estrógenos aumentan los niveles de IL-33 en el pulmón, mejorando así la inflamación tipo 2 inducida por alérgenos (11). De acuerdo con los hallazgos de ratones, las hembras adultas con asma moderada a severa tienen un mayor número de ILC2 circulantes en comparación con los hombres adultos (11).
La compleja relación entre ILC2 y otras células inmunes a través de la producción de citocinas y/o células: las interacciones celulares han llevado a un interés creciente en el destino de los ILC2 activados incluso después de la resolución de la inflamación de las vías respiratorias (18). Los datos de los estudios murinos muestran que, tras la reestimulación, los ILC2s, previamente activados in vivo (por IL-33, Alternaria alternata, papaína o la serina proteasa de Aspergillus oryzae), responden más drásticamente en comparación con sus contrapartes ingenuas, a través de una proliferación mejorada y citoquina producción (19, 20). Estos ILC2 similares a la memoria tienen un perfil de expresión génica similar al de las células T de memoria CD8+; También expresan niveles más altos de la subunidad IL-17RB del receptor IL-25 (IL-25R) y responden a la administración intranasal de IL-25, una respuesta que falta en ILC2 de ratones ingenuos (19). Más recientemente, los programas de expresión génica se han relacionado con una mayor capacidad de respuesta y desarrollo de la memoria en ILC2, uno de los cuales, el llamado programa de ‘preparación’, incluye el factor de transcripción STAT6 (20), un inductor bien conocido de inflamación tipo 2 (21).
Aquí, hemos investigado las respuestas de ILC2 en modelos de enfermedad alérgica de las vías respiratorias e inflamación tipo 2 en la que los ratones machos y hembras se sensibilizaron mediante el suministro pulmonar de ovalbúmina (OVA) en presencia de IL-33. Los ratones fueron desafiados un mes después mediante la entrega de citocinas OVA o alarmina al pulmón. Nuestros datos muestran que las hembras tenían un mayor número de eosinófilos e ILC2 en el pulmón después del desafío secundario con OVA o alarminas y que incluso sin desafío, los ILC2 de pulmón con experiencia en IL-33 persistieron en mayores niveles durante al menos un mes en hombres y mujeres. . Si bien el número de ILC2 no difirió, su fenotipo lo hizo. Los ILC2 de ratones hembra expresaron mayores niveles de ST2; y un mayor número de ILC2 en hembras expresaron el IL25R, que se asoció con una mayor propensión a la producción de citocinas tras la administración de IL-25 o IL-33. Además, la capacidad de respuesta mejorada a IL-25 estuvo ausente en ILC2S de los ratones Stat6 Knockout (KO). Juntos, nuestros datos sugieren que tras la activación previa por IL-33, los ILC2 de pulmón en ratones hembras están preparados para ejercer funciones efectoras más fuertes después del desafío secundario con estímulos dispares.
Materiales y métodos
Ratones
Masculino y femenino, ratones Balb/C de tipo salvaje y STAT6 (KO) Balb/C, originalmente comprados en Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) fueron criados en casa en condiciones libres de patógenos en la División de Recursos Animales en el Instituto de Investigación de la Universidad de McGill Health Centro y utilizado a las edades de 5 a 6 semanas. Los ratones se mantuvieron en jaulas suplementadas con agua y alimentos irradiados en todo momento. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de McGill y se realizaron siguiendo las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.
Estimulación in vivo
Los ratones se anestesiaron brevemente con isoflurano, seguido de tratamiento intranasal con IL-33 (0.05 µg) y/o OVA (50 µg) en un volumen de 30 µl en los días 1 y 2. Se usó OVA solo como control negativo. IL-33 se adquirió de Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA) y OVA se adquirió de Worthington Biochemical Corp (Lakewood, NJ). Se permitió que los ratones descansen durante 4 semanas y luego, en algunos experimentos, se sacrificaron directamente o desafiados con OVA (10 µg) diariamente por cada uno de 4 días y sacrificados 48 h más tarde para la recolección y procesamiento de pulmones. En otros experimentos, los ratones se sensibilizaron como anteriormente y 4 semanas después, tratados con una sola inyección intranasal de IL-25 (0.25 µg) o IL-33 (0.25 µg) o solución salina y sacrificada 48 h más tarde. En experimentos para examinar si la ausencia de actividad de STAT6 afectó las respuestas de ILC2 similares a la memoria, los ratones hembra de tipo salvaje y STAT6 KO fueron tratados con IL-33 antes del descanso de 4 semanas y la entrega in vivo, como anteriormente, con solución salina o IL -25.
Digestión de pulmón
Se recogieron pulmones enteros en medio RPMI. Luego, el tejido pulmonar se puso y se digirió durante 35 minutos a 37 ° C en 1 ml de solución enzimática compuesta por RPMI con DNasa I (200 µg/ml; Sigma-Aldrich, Oakville, ON), Liberase ™ (100 µg/ml; Roche , Indianapolis, in), hialuronidasa 1a (1 mg/ml; tecnologías de vida, Carlsbad, CA) y colagenasa XI (250 µg/ml; tecnologías de vida). La digestión enzimática se detuvo mediante la adición de 1 ml de RPMI + 5% de FBS (22, 23) + 1% de penicilina/estreptomicina. Los glóbulos rojos se lisaron agregando 3 ml de tampón de lisis de cloruro de amonio (ACK), seguido de 2 lavados con RPMI + 5% FBS + 1% de penicilina/estreptomicina después del cual las células se filtraron, contaron y luego se diluyeron usando RPMI usando RPMI + 5% de FBS para obtener 2 × 106 y 1 × 106 células para tinción de ILC2 y eosinófilos, respectivamente.
Tinción de citometría de flujo
Todas las células para el análisis de citometría de flujo se lavaron primero con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de mancharse. Luego, las células se colocaron en placas de pozos 96 de fondo redondo bajo. Los ILC2 se incubaron con 0.665 µl/ml de parada de Golgi (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) en RPMI que contenía 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM, 10 mm Hepes y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y quite y y y estén 55 µM 2-mercaptoetanol durante 4 ha 37 ° C y 5% de CO2. Luego, las células se lavaron con PBS y se incubaron en la oscuridad a 4 ° C con tinte de viabilidad Eflour789 (Ebioscience, San Diego, CA) durante 20 minutos. A continuación, las células se lavaron y se incubaron durante 5 minutos con CD16/CD32 anti-ratón (bloque FC) (BD Biosciences, San José, CA). Los ILC2 se tiñeron usando BUV395-CD45.2, EF-450-THY1.2, PECY7-CD127, PERCP-EF710-ST2, BV605-KLRG1, BV510-MHCII, BV786-IL-17RB y una combinación de antibedios conectados …
(Tagstotransilate) IL-33 (T) IL-25 (T) ILC2 (T) Inmunidad entrenada (T) TH2 Inmunidad adaptativa (T) Inflamación pulmonar (T) Sistema de neumología/respiratorio
