Resumen
Antecedentes
El brote de la enfermedad del coronavirus 2019 (Covid-19) reveló la susceptibilidad de los pacientes de edad avanzada a las infecciones del virus respiratorio, que muestra la senescencia celular o los perfiles inflamatorios persistentes subclínicos y favoreciendo el desarrollo de neumonía severa.
Métodos
En nuestro estudio, evaluamos la influencia potencial del envejecimiento pulmonar en la eficiencia de la replicación del virus de la influenza A (IAV) y el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), además de determinar las respuestas proinflamatorias y antivirales del tejido pulmonar distal.
Resultados
Utilizando rodajas pulmonares cortadas con precisión (PCL) de donantes de diferentes edades, encontramos que la pandemia H1N1 y Avian H5N1 IAV replicadas en el parénquima pulmonar con alta eficacia. A diferencia de estas cepas de IAV, el aislado temprano SARS-CoV-2 y la variante de preocupación delta (VOC) se replicaron de manera menos eficiente en las PCL. Curiosamente, ambos virus mostraron una replicación reducida en PCL de los donantes más antiguos en comparación con los donantes más jóvenes, lo que sugiere que el tejido pulmonar envejecido representa un entorno subóptimo para la replicación viral. Independientemente de las cargas virales dependientes de la edad, los PCL respondieron a la infección por H5N1 IAV mediante una inducción de IL-6 e IP10/CXCL10, tanto a nivel de ARNm como de proteína, como a la infección por H1N1 IAV mediante la inducción del ARNm de IP10/CXCL10. Finalmente, mientras que la infección SARS-CoV-2 y H1N1 IAV no estaba causando la muerte celular detectable, la infección por H5N1 IAV condujo a más citotoxicidad e indujo respuestas significativas de interferón temprano.
Conclusiones
En resumen, nuestros hallazgos sugieren que el tejido pulmonar envejecido podría no favorecer la diseminación viral, señalando un papel determinante de los mecanismos inmunes desregulados en el desarrollo de enfermedades severas.
Introducción
La neumonía viral inducida por el virus de la influenza A (IAV) y el síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) es una causa principal de muerte por enfermedades infecciosas en todo el mundo (1,2,3). Es importante destacar que existe una profunda diferencia en la gravedad clínica de la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19) según la edad. Específicamente, mientras que la edad avanzada se asocia con un mayor riesgo de enfermedades graves y muerte, los niños rara vez se ven afectados y la neumonía severa es inusual en esta población (4). Por otro lado, la infección por IAV se asocia con una mayor mortalidad en pacientes mayores, pero también representa un riesgo de enfermedad grave en niños pequeños (5,6,7).
La mayor susceptibilidad de los ancianos a las infecciones graves del virus respiratorio se debe a una combinación de factores asociados con el envejecimiento, incluidas las comorbilidades, una disminución en la función pulmonar, la senescencia celular e inmunidad desregulada. Esto incluye el deterioro de los mecanismos inmunes innatos locales, un fenotipo hiperinflamatorio relacionado con la edad llamado «inflamación» y una disminución en las respuestas humorales y celulares, denominadas «inmunostescencia» (8,9,10). La infección con una serie de virus, como el virus del sarampión, el virus sincitial respiratorio humano y los coronavirus, puede inducir senescencia celular prematura (11). Curiosamente, la infección del tejido pulmonar por el envejecimiento prematuro inducido por IAV indicó la aparición de células senescentes y, posteriormente, la infección de las células senescentes dio como resultado una mayor replicación viral (12). Del mismo modo, se demostró que SARS-CoV-2 induce la senescencia a través de múltiples mecanismos con el potencial de desencadenar la «tormenta de citocinas» relacionada con el covid-19 y el daño de los órganos (13).
Sin embargo, el impacto de la edad y el microambiente pulmonar local en la infección aguda del virus respiratorio no se ha dilucidado hasta ahora, principalmente debido a limitaciones experimentales y porque no hay un modelo animal adecuado disponible. Estudios anteriores que utilizan explantes pulmonares, incluidas biopsias pulmonares sin procesar (14,15,16,17,18) y rodajas pulmonares cortadas con precisión (PCLS) (19), han demostrado la alta eficiencia de la replicación de IAV en el tejido pulmonar cultivado del tracto respiratorio inferior, lo que los convierte en modelos valiosos para estudiar la infección y la virulencia de IAV. Los explantes pulmonar también se han utilizado para estudiar el potencial de replicación de las variantes SARS-CoV-2, el tropismo celular de SARS-CoV y SARS-CoV-2, y las respuestas inmunes posteriores ((17, 18, 20, 21). Sin embargo, estos estudios no examinaron la influencia de la edad de los donantes de tejido. Es de destacar que nosotros y otros hemos demostrado una susceptibilidad dependiente de la edad del epitelio respiratorio superior hacia la infección del virus respiratorio (22, 23). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las características del pulmón de individuos mayores, particularmente el epitelio alveolar del pulmón distal, pueden influir en la replicación viral y contribuir a los resultados adversos durante las infecciones de IAV o SARS-CoV-2 en los ancianos. Empleamos un modelo de infección por virus respiratorio basado en cultivos de PCLS (24,25,26,27). Este modelo de cultivo conserva las estructuras bronquiolares y alveolares con cambios mínimos durante el cultivo durante hasta dos semanas (28), permitiendo el estudio del comportamiento celular y las interacciones celulares -células en su entorno celular nativo (27). Debido a estas características, las PCL están cerrando la brecha entre los sistemas simples in vitro y complejos in vivo (25), al recapitular las condiciones fisiopatológicas y las respuestas inflamatorias locales, que se cree que ocurren in vivo (29). La generación de secciones de tejido definidas garantiza una mejor homogeneidad y reproducibilidad, reduciendo así el grado de variabilidad entre las réplicas (30, 31).
En este estudio, investigamos la replicación IAV y SARS-CoV-2 y las respuestas proinflamatorias y antivirales inducidas por la infección de tejido pulmonar distal «más antiguo» versus «más joven». Utilizamos PCL humanos, obtenidos de varios donantes con diferentes edades, para estudios de infección viral que utiliza un aislado temprano de SARS-CoV-2 y un aislado del Delta VOC, así como el Pandemic IAV H1N1 2009 y Avian IAV H5N1.
Materiales y métodos
Declaración de bioseguridad
Todos los experimentos con H5N1/A/Turquía/1/2005 infecciosos y SARS-CoV-2 se realizaron en un Laboratorio de contención de nivel 3 (BSL3) mejorado en el Instituto de Virología e Inmunología, Mittelhäusern, Suiza, que siguió a los procedimientos operativos estándar aprobados de la Instalación BL3 de Autoridades relevantes en Switzerland (Authoration No. Todo el personal involucrado en estos experimentos recibió capacitación avanzada y usaba equipos de protección personal apropiados, incluido Tyvek en general y capó, y un respirador Júpiter o Versaflo con un sistema de filtro HEPA (los 3 m).
Líneas celulares y condiciones de cultivo
Georg Herrler (Universidad de Medicina Veterinaria Hannover, Alemania) dio amablemente las células de Madin-Darby Riñón tipo II (MDCK-II) y se cultivaron en MEM (Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero bovino fetal al 5% (FBS). El riñón embrionario humano 293 T (HEK-293 T) células (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, EE. UU.; CRL-3216) se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS. Las células VerOE6 fueron amablemente proporcionadas por Doreen Muth, Marcel Müller y Christian Drosten (Charité, Berlín, Alemania) y cultivados en DMEM Glutamax suplementado con 10% de FBS y HEPES al 1% (todos Thermo Fisher Scientific). Las células VerOE6-TMPRSS2 (NIBSC Research Reactivo de reactivo, Reino Unido) se cultivaron en DMEM Glutamax con 10% de FBS y 1X aminoácidos no esenciales (Thermo Fisher Scientific). Al pasarse, se agregaron 200 µg/ml de genetina (G418) al medio de cultivo. Todas las células se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO2.
Cultivos de corte pulmonar con precisión humana
Los PCL humanos se prepararon como lo informaron anteriormente (32, 33). Brevemente, se recolectaron el tejido pulmonar distante de las resecciones de los bordes tumorales (margen sin tumores de un mínimo de 5 cm), sin signos de inflamación o enfisema, en el Hospital IneSpital, Bern University (aprobado por la Comisión de Ética de Bernés, Licencia: Kek-Be_2018-01801). Todos los donantes fueron informados y firmaron un consentimiento por escrito antes de la inclusión. Todas las resecciones de tejido pulmonar fueron probadas para SARS-CoV-2 por QPCR. Una vez en el laboratorio, los tejidos se procesaron dentro de las seis horas posteriores a la cirugía: los tejidos pulmonares (2%) de baja fusión de 1 cm3 (2%) se cortaron los tejidos pulmonares en rodajas de 400 μm en el microtoma vibrante VF-310-0Z (Precisionario) de 400 μm en las recomendaciones del fabricante. Las rodajas se colocaron en placas de 12 pocillos con medio DMEM Glutamax, FBS al 1%, HEPES 20 mm y 1x antibiótico-antibiótico (Thermo Fisher). Los PCL se incubaron a 37 ° C, al 5% de CO2 en una incubadora humidificada, y el medio se cambió todos los días durante una o siete días antes de la infección.
Células epiteliales nasales primarias bien diferenciadas humanas
La generación de cultivos de células epiteliales nasales bien diferenciadas humanas (WD-NEC) se realizó como se describió anteriormente (32). En resumen, los NEC primarios se obtuvieron comercialmente (Epithelix Sàrl, Ginebra, Suiza). Las células se sembraron y se mantuvieron en insertos Transwell de 24 pocillos (Corning) en la interfaz aire-líquido en el medio de cultivo Mucilair (Epithelix Sàrl, Ginebra, Suiza) en una incubadora humidificada a 37 ℃, 5% de CO2. El medio de cultivo se cambió cada tres días.
Virus
El sistema de genética inversa de ocho plásmidos PHW2000 de H1N1 A/Hamburgo/4/2009 (GenBank Accession-. Klenk (Universidad de Marburg, Marburg, Alemania). Para la generación de virus infeccioso, 106 células MDCK-II y 2 × 106 células T HEK-293 se sembraron en platos de cultivo celular de 10 cm y se cultivaron durante la noche a 37 ° C, 5% de CO2. El cocultivo se transfectó con el conjunto de 8-plásmido (2 μg de cada plásmido) usando el reactivo de transfección de Lipofectamine 2000 (Fisher Scientific). A las 24 h después de la transfección, las células se lavaron con PBS y se mantuvieron en medio libre de suero suplementado con 0.2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA), 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina y 1 μg/ml de tripsina acetilada. El pasaje 0 se obtuvo seis días después de la transfección, cuando se recogió el medio celular, FBS se agregó a una concentración final del 5% y los restos celulares se eliminaron por …
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