Abstracto
Fondo
La evidencia clínica y experimental muestra que el volumen de líquido pulmonar es un modulador del crecimiento pulmonar fetal con un valor importante en el tratamiento de la hipoplasia pulmonar fetal. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos que subyacen a estas dinámicas morfológicas ha sido tema de múltiples investigaciones con, sin embargo, resultados limitados, en parte debido a la dificultad de capturar o recapitular estos movimientos en el laboratorio. En este sentido, este estudio tiene como objetivo establecer un modelo ex vivo que permita estudiar la función del líquido pulmonar en la morfogénesis de ramificación e identificar los mecanismos moleculares/celulares posteriores.
Métodos
Se seleccionó un cultivo de explantes de pulmón ex vivo como modelo para estudiar la morfogénesis de ramificación y se realizaron inyecciones intraluminales para cambiar la composición del líquido pulmonar. Cloruro distinto (Cl−) concentraciones (5,8, 29, 143 y 715 mM) o Cl− inhibidores de canales [antracene-9-carboxylic acid (A9C), cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor172 (CFTRinh), and calcium-dependent Cl− channel inhibitorA01 (CaCCinh)] se inyectaron en la luz pulmonar en dos momentos, día 0 (D0) y D2. En D4, se realizaron análisis morfológicos y moleculares en términos de morfogénesis de ramificación, distribución espacial (inmunofluorescencia) y cuantificación de proteínas (western blot) de mecanorreceptores (PIEZO1 y PIEZO2), neuroendocrinos (bombesina, grelina y PGP9.5) y músculo liso. [alpha-smooth muscle actin (α-SMA) and myosin light chain 2 (MLC2)] marcadores
Resultados
Por primera vez, describimos inyecciones intraluminales efectivas en D0 y D2 y demostramos movimientos intraluminales en D4 en cultivos de explantes de pulmón ex vivo. A través del ensayo de inmunofluorescencia en la morfogénesis de ramificación in vivo y ex vivo, mostramos que PGP9.5 se colocaliza con los receptores PIEZO1 y PIEZO2. El crecimiento pulmonar fetal aumenta a mayor [Cl−]Cl 715 mM−, a través de la sobreexpresión de PIEZO1, PIEZO2, grelina, bombesina, MLC2 y α-SMA. Por el contrario, la inyección intraluminal de CFTRinh o CaCCinh disminuye el crecimiento pulmonar fetal y la expresión de PIEZO1, PIEZO2, grelina, bombesina, MLC2 y α-SMA. Finalmente, la inhibición de PIEZO1/PIEZO2 por GsMTx4 disminuye la morfogénesis de ramificación y la expresión de grelina, bombesina, MLC2 y α-SMA de forma independiente a la inyección intraluminal.
Conclusiones
Nuestros resultados identifican PIEZO1/PIEZO2 expresado en células neuroendocrinas como un regulador del crecimiento pulmonar fetal inducido por líquido pulmonar.
Fondo
Las fuerzas físicas ejercidas sobre el pulmón fetal en desarrollo, concretamente por el fluido pulmonar intraluminal y las contracciones peristálticas de las vías respiratorias, son reguladores importantes de la morfogénesis de ramificación del pulmón fetal. El líquido pulmonar y su presión hidráulica intraluminal en el útero tienen dos fuentes: el líquido amniótico y las secreciones de las células epiteliales en la luz de las vías respiratorias, que son impulsadas osmóticamente por el cloruro activo (Cl−) secreción a través de Cl− canales; esto da lugar a un flujo continuo hacia adelante de líquido pulmonar que drena hacia el líquido amniótico. La circulación fisiológica del líquido pulmonar que llena los espacios de aire es fundamental para el desarrollo pulmonar. De hecho, si se altera, el crecimiento y la maduración de los pulmones se ven afectados. Por ejemplo, el exceso de drenaje de líquidos durante la vida fetal o una disminución de la presión del líquido debido a la ruptura prematura de las membranas o al oligohidramnios se asocian con hipoplasia pulmonar con pulmones poco ramificados, que es una de las principales causas de insuficiencia respiratoria y mortalidad en los recién nacidos. [1,2,3,4,5,6,7,8]. Por el contrario, la evidencia experimental muestra el aumento del volumen de líquido pulmonar como promotor del crecimiento pulmonar fetal [2, 9]. De hecho, la oclusión traqueal prenatal aumenta el volumen de líquido pulmonar, la presión luminal y la expansión y, en consecuencia, aumenta la tasa de ramificación. [5, 10,11,12,13]. Esta evidencia permitió el desarrollo de la oclusión traqueal endoluminal fetoscópica (FETO) como tratamiento para los casos más severos de hipoplasia pulmonar en el contexto de la hernia diafragmática congénita (HDC). [13,14,15,16].
Se han realizado estudios moleculares para determinar los mecanismos subyacentes a la producción de líquido pulmonar y la expansión pulmonar. En resumen, el líquido pulmonar se produce mediante un mecanismo dependiente de la adenosina trifosfatasa de sodio-potasio (Na+/K+-ATPasa) bombas y Na+/K+/2cloruro (Cl−) cotransportadores ubicados en la superficie basolateral de las células epiteliales pulmonares [17,18,19,20,21]que estimulan el Cl apical− secreción a través del regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) o del canal de cloruro dependiente de calcio (CaCC). Finalmente, es el aumento de Cl intraluminal− concentración ([Cl−]) que favorece el movimiento de sodio y agua hacia la luz y promueve la formación de líquido pulmonar y la consiguiente expansión pulmonar [5, 18,19,20,21,22,23,24,25]. Además, la inhibición de los canales iónicos apicales, como CFTR, la proteína transmembrana 16A (TMEM16A), el canal de cloruro 2 (ClC2) o el receptor de calcio extracelular (CaR), induce defectos morfológicos clave en la morfogénesis de ramificación. [18, 20, 26,27,28,29,30].
Recientemente, un área emergente, la mecanotransducción, demostró que las células pueden traducir un estímulo mecánico, como la presión, en señales bioquímicas. Sin embargo, aún no se han determinado los mecanismos por los cuales se detecta la presión en el pulmón. En el pulmón fetal, las células del músculo liso son esenciales para las contracciones peristálticas de las vías respiratorias, mientras que las células neuroendocrinas pulmonares (PNEC)/cuerpos neuroepiteliales (NEB) están indicados como quimiosensores y mecanosensores, particularmente durante el período perinatal. De hecho, las contracciones peristálticas de las vías respiratorias generan no solo el flujo de líquido intraluminal, sino también la distensión y relajación periódicas de las yemas terminales, esenciales para la morfogénesis de ramificación. [31,32,33,34]. Por el contrario, las PNEC/NEB son promotoras del crecimiento pulmonar fetal in vivo y ex vivo [35,36,37,38,39] y sensores para hipoxia, hipercapnia, acidosis o estiramiento de las vías respiratorias [40] con funciones indefinidas en el desarrollo pulmonar fetal. Una publicación reciente mostró que PIEZO2, un mecanosensor conocido [41,42,43]se expresa en NEB, lo que indica que los NEB pueden detectar el estiramiento mecánico [41]. Este estudio también reporta la presencia de PIEZO2 en neuronas sensoriales y su importancia en la regulación de la expansión pulmonar y la respiración neonatal eficiente en un mecanismo dependiente del sistema nervioso central [41]. Sin embargo, la inactivación de PIEZO2 en las neuronas sensoriales, pero no en las PNEC/NEB, fue esencial para la transición respiratoria al nacer. [41]manteniendo la importancia de la sensación de estiramiento por PNECs poco clara.
Las proteínas PIEZO, PIEZO1 y PIEZO2, son canales catiónicos activados mecánicamente que forman complejos homomultiméricos suficientes para mediar corrientes inducidas mecánicamente. [44,45,46]. El trabajo anterior demostró que PIEZO1 es esencial en la regulación de la presión arterial basal y el volumen celular normal en los glóbulos rojos en la edad adulta. [43, 47]mientras que PIEZO2 mediaba los procesos sensoriales [48,49,50] y la fisiología respiratoria [41].
En este contexto, para investigar la señalización de mecanotransducción intrínseca al crecimiento pulmonar fetal, exploramos las células neuroendocrinas y los mecanorreceptores como mediadores de la composición del fluido intraluminal durante la morfogénesis ramificada.
Métodos
animales
Ratas Sprague-Dawley hembra (225 g; Charles-River; España) se mantuvieron en jaulas apropiadas en condiciones controladas y se alimentaron con alimento sólido comercial. Las ratas se aparearon y se controlaron diariamente en busca de tapones vaginales. El día del taponamiento se definió como el día embrionario (E) 0,5 con fines de datación temporal. Los embriones se diseccionaron en E13.5 o E17.5, y los pulmones embrionarios se extrajeron para su posterior análisis.
Cultivos de explantes de pulmón
La recolección y disección de pulmones E13.5 se realizaron en PBS bajo un microscopio de disección (Leica MZFLIII, Suiza). Luego, los pulmones se transfirieron a las membranas de nucleoporo (Cat No. TETP01300, Whatman, EE. UU.) y se cultivaron en un medio completo[50%deDMEMbajoenglucosa50%demezcladenutrientesF-12(GibcoEEUU)suplementadocon[50%DMEMlowglucose50%nutrientmixtureF-12(GibcoUSA)supplementedwith
