Resumen
Antecedentes
La lesión pulmonar aguda (ALI) después de una neumonía implica inflamación incontrolada y lesión tisular, lo que conduce a una alta mortalidad. Anteriormente confirmamos el aumento significativo del contenido de carga y la producción de vesículas extracelulares (EV) en células estromales mesenquimales humanas (thMSC) preacondicionadas con trombina en comparación con aquellas en métodos de preacondicionamiento ingenuos y otros. Este estudio tuvo como objetivo investigar la eficacia terapéutica de los vehículos eléctricos derivados de thMSC en la protección contra la inflamación y la lesión tisular en un modelo de ratón ALI inducido por Escherichia coli (E. coli).
Métodos
In vitro, las células RAW 264.7 se estimularon con 0,1 µg/ml de liposacáridos (LPS) durante 1 h, luego se trataron con PBS (LPS Ctrl) o 5 × 107 partículas de thMSC-EV (LPS + thMSC-EV) durante 24 h. . Se recogieron células y medios para citometría de flujo y ELISA. In vivo, los ratones ICR fueron anestesiados, intubados y administrados 2 × 107 UFC/100 µl de E. coli. 50 minutos después, a los ratones se les administró 50 µl de solución salina (ECS) o 1 × 109 partículas/50 µl de thMSC-EV (EME). Tres días después, se evaluó la eficacia terapéutica de las thMSC-EV mediante tejido pulmonar extraído, líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y tomografías computarizadas in vivo. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional con la prueba TUKEY post-hoc para comparar estadísticamente los grupos experimentales.
Resultados
In vitro, los niveles de IL-1β, CCL-2 y MMP-9 fueron significativamente más bajos en el grupo LPS + thMSC-EV que en el grupo LPS Ctrl. Los porcentajes de macrófagos M1 en los grupos control normal, LPS Ctrl y LPS + thMSC-EV fueron 12,5, 98,4 y 65,9%, respectivamente. In vivo, el grupo EME exhibió puntuaciones histológicas significativamente más bajas para congestión alveolar, hemorragia, engrosamiento de la pared e infiltración de leucocitos que el grupo ECS. La relación húmedo-seco para los pulmones fue significativamente menor en el grupo EME que en el grupo ECS. Los niveles BALF de CCL2, TNF-a e IL-6 fueron significativamente más bajos en el grupo EME que en el grupo ECS. El análisis de TC in vivo reveló un porcentaje significativamente menor de pulmones dañados en el grupo EME que en el grupo ECS.
Conclusión
La administración intratraqueal de thMSC-EV redujo significativamente la inflamación inducida por E. coli y el daño al tejido pulmonar. En general, estos resultados sugieren que los thMSC-EV terapéuticamente mejorados son una nueva opción terapéutica prometedora para el SDRA/ALI.
Fondo
El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y la lesión pulmonar aguda grave (ALI) son enfermedades respiratorias críticas caracterizadas por inflamación incontrolada, daño pulmonar bilateral, fibrosis y edema pulmonar no cardiogénico.1,2,3). El SDRA/ALI se desarrolla por causas primarias que incluyen neumonía bacteriana o viral, inhalación de sustancias tóxicas o sepsis, y conduce a un mal pronóstico y altas tasas de mortalidad.2, 4, 5). Las estrategias de tratamiento para el SDRA/ALI tradicionalmente implican combinaciones de antibióticos y posición prona para abordar los síntomas individuales sin opciones de tratamiento definidas. Considerando la gravedad y las diversas complicaciones, como inflamación, edema y fibrosis, se necesita con urgencia un enfoque terapéutico integral para mejorar la fisiopatología general de la ALI.6, 7).
Recientemente, se están explorando nuevas modalidades terapéuticas para el SDRA/ALI utilizando células estromales mesenquimales (MSC) o vehículos extracelulares (EV) derivados de MSC (8,9,10). La eficacia terapéutica de las MSC depende de la señalización paracrina, con factores bioactivos liberados en los vehículos eléctricos (11,12,13). La mejora paracrina de las MSC a través de varios métodos de cebado se ha mostrado prometedora porque el contenido de la carga de los vehículos eléctricos depende del estímulo (14, 15). Nuestras investigaciones previas revelaron que la producción de EV y el contenido de carga aumentan significativamente, principalmente a través del receptor activado por proteinasa (PAR)-1 y en parte a través de una vía dependiente de PAR3, en MSC humanas preacondicionadas con trombina (thMSC) en comparación con aquellas en condiciones previas ingenuas y de otro tipo. métodos (16, 17). Además, el trasplante de thMSC en modelos de ratas neonatales con hemorragia intraventricular y encefalopatía hipóxico-isquémica, así como EV derivados de thMSC en meningitis neonatal, confirmó su importante eficacia terapéutica para atenuar la inflamación, disminuir la muerte celular y reducir las lesiones tisulares posteriores.18,19,20).
Entre los procesos fisiopatológicos de la ALI, la inflamación, la infiltración de leucocitos, la alteración de la permeabilidad vascular, el edema y la fibrosis están estrechamente asociados con la señalización PAR, un miembro de la familia de receptores acoplados a proteína G expresados en células epiteliales, endoteliales e inmunes.21, 22). En la inflamación y el daño tisular, el aumento de la producción de trombina escinde y activa los PAR desencadenando una cascada de reacciones que conducen a la liberación de mediadores protrombóticos, citocinas inflamatorias y quimiocinas IL-6, TNF-α y CCL2 (22). Esta cascada aumenta la permeabilidad vascular, la activación endotelial y el edema, provocando en última instancia una lesión tisular grave.23,24,25).
Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los vehículos eléctricos derivados de MSC con función mejorada mediante la activación de PAR mediada por precondicionamiento de trombina (thMSC-EV) proporcionarían una protección sustancial contra el SDRA/ALI (17). Este estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia terapéutica de los vehículos eléctricos de MSC derivadas de gelatina de Warton (thWJ-MSC) preacondicionadas con trombina en un modelo de ratón ALI inducido por Escherichia coli (E. coli). Hasta donde sabemos, esta es la primera investigación de vehículos eléctricos derivados de MSC preacondicionados con trombina en un modelo preclínico de SDRA/ALI.
Métodos
Preparación de MSC derivadas de WJ
Las WJ-MSC humanas fueron proporcionadas por el Centro de buenas prácticas de fabricación del Samsung Medical Center y se ampliaron como se describió anteriormente (20); En este estudio se utilizaron WJ-MSC del pase 6 y se caracterizaron por sus marcadores de superficie, tasa de proliferación y potencial de diferenciación de acuerdo con los criterios mínimos de MSC establecidos por el ISCT (Figura complementaria T1). Las WJ-MSC se cultivaron en medio mínimo esencial (MEM)-α (Gibco; Grand Island, NY, EE. UU.) con suero bovino fetal al 10 % (FBS. Gibco; Grand Island, NY, EE. UU.) y gentamicina al 0,1 % (Gibco; Grand Island, NY, EE. UU.) en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 ℃. El preacondicionamiento de trombina se realizó siguiendo el método previamente establecido (20). Brevemente, con una confluencia del 90%, el medio de cultivo se lavó tres veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Welgene; Daegu, Corea del Sur) para eliminar el FBS residual y se reemplazó con MEMα sin suero suplementado con 20 unidades/ml de trombina (Reyon Pharmaceutical Co, Ltd; Seúl, Corea del Sur) durante 3 h. Los niveles de HGF y VEGF en WJ-MSC preacondicionadas con trombina medidos en el medio acondicionado se presentan en la Figura complementaria T2.
Aislamiento y cuantificación de vehículos eléctricos
El medio preacondicionado con trombina de WJ-MSC se recogió y se filtró utilizando un sistema de filtración al vacío con tapa de botella de 0,2 μm (Corning; Corning, NY, EE. UU.). Luego, los vehículos eléctricos se aislaron y diafiltraron en DPBS utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial (KrosFlo® KR2i, Repligen; Waltham, MA, EE. UU.) con un tamaño de poro de membrana mPES de 300 kDa (S02-E300-05-N, Repligen; Waltham, MA, EE. UU. ). Posteriormente, los vehículos eléctricos concentrados se filtraron mediante un filtro de 0,2 μm (S6534-FMOSK, Sartorius; Göttingen, Alemania) y se analizaron mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NanoSight NS300; Malvern, Malvern, Reino Unido) (Fig. 1). Los thMSC-EV se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70 ℃ hasta experimentos posteriores. Se confirmaron los thMSC-EV de los marcadores GM130 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.), TSG101 (1:1000; Abcam, Cambridge, Reino Unido) y flotillina-1 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) mediante Western Blot. El tamaño de los MSC-EV ingenuos se presenta en la figura complementaria T3.
Figura 1Caracterización de vehículos eléctricos derivados de WJ-MSC preacondicionados con trombina. (A) El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) evaluó la concentración de proteínas y la distribución de tamaños. (B) Los marcadores específicos de EV se analizaron mediante transferencia Western. GM130, marcador EV negativo (marcador de membrana de Golgi); TGS101 y Flotillin-1 son marcadores positivos de la superficie de EV. Las imágenes de transferencia completa se pueden encontrar en la Figura S9. GM130, proteína 130 de la matriz de Golgi; TGS101, gen de susceptibilidad tumoral 101; FLOT-1, Flotillina-1
Imagen a tamaño completoPreparación de E. coli
La cepa E69 de E. coli resistente a la kanamicina fue amablemente proporcionada por el Dr. Kwang Sik Kim del Hospital Johns Hopkins. La E. coli se cultivó en suspensión durante la noche en caldo Brain-Heart-Infusion (BHI, BD Bioscience; Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) con 53 µg/mL de kanamicina (Sigma Aldrich; Burlington, Massachusetts, EE. UU.) a 37 °C y 200 rpm. Se diluyeron recientemente 300 µl de caldo de cultivo en 7 ml de caldo BHI, se incubaron más durante 2 h y se centrifugaron durante 7 min a 3500 rpm. La densidad óptica (DO) se midió a 600 nm y se diluyó a un valor de DO de aproximadamente 0,6 utilizando un espectrofotómetro Multiskan Sky (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Luego se esparcieron 100 µl de cultivo de E. coli en placas de agar BHI utilizando un esparcidor esterilizado (SPL Life Science, Pocheon-si, Corea del Sur) y se incubaron las placas durante la noche a 37 °C. La concentración final de E. coli en 50 µl de solución salina normal fue de 107 unidades formadoras de colonias (UFC).
Modelado de inflamación ALI in vitro inducida por LPS utilizando macrófagos alveolares
La línea celular de macrófagos alveolares, RAW 264.7 (Korean Cell Line Bank; Seúl, República de Corea), se mantuvo en medio Eagle modificado de Dulbecco (Gibco; Grand Island, NY, EE. UU.) suplementado con 10 % de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina (Invitrogen , Carlsbad, California, EE. UU.) en una cámara humidificada con 5% de CO2 a 37 ℃, como se describió anteriormente (26). Con una confluencia del 80 %, se estimularon células RAW264.7 con 0,1 µg/ml de lipopolisacárido (LPS O111:B4. Sigma Aldrich; Burlington, Massachusetts, EE. UU.) durante 1 h en una placa de 96 pocillos. Luego, se agregaron volúmenes iguales (5 µL) de PBS y thMSC-EV (5 × 107 partículas / 5 µL) como los grupos LPS Ctrl y LPS + thMSC-EV, respectivamente, y se mantuvieron durante 24 h. Se recolectaron medios de cultivo para el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de proinflamatorios…
